人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(totalsaponins of panaxginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化。结果显示:10-70μg/mlTSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/ml效果最为明显。结论:合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。

人参总皂甙体外诱导CD34^+造血干/祖细胞增殖的作用

目的：探讨人参总皂甙(TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞(HSC/HPC)增殖的作用。方法：收集人脐血细胞,采用Stemsep TM干细胞分选系统分离纯化CD34^+HSC/HPC,经不同剂量TSPG加入不同造血生长因子组合进行培养,检测细胞总数、CD34^+细胞及集落形成细胞总数(CFCs)的变化。结果：TSPG 10、20、50和70μg/ml均可不同程度地提高细胞总数、CFCs和CD34^+细胞扩增倍数,TSPG 50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFCs和CD34^+细胞分别增至(2470．50±79．96)倍、(53．96±4．29)倍和(21．86士3．09)倍。结论：合适剂量的TSPG能够促进CD34^+造血干/祖细胞体外增殖。

脐血CD34^+造血干/祖细胞基因表达图谱的研究

目的通过脐血CD34+造血干/祖细胞的基因表达分析,理解造血干/祖细胞生物学特性。方法利用Min-iMACS免疫磁珠法从脐血细胞中分离CD34+造血干/祖细胞,提取总RNA,用SMART-PCR技术从微量RNA中扩增产生足够量的cDNA用于高密度点阵膜分析检测CD34+造血干/祖细胞表达的基因。结果在所检测的588个基因中,发现63个基因具有显著的表达水平,其中18个基因强表达。这些基因主要涉及造血干细胞增殖、分化、应激响应、凋亡、转录调节以及细胞周期等。结论对理解脐血干/祖细胞生物学性质以及指导造血干细胞体外培养提供了分子生物学基础。

青蒿琥酯对K562细胞和脐血CD34^+造血干/祖细胞的选择性作用

目的探讨青蒿琥酯(artesunate,AST)对K562细胞和正常造血干/祖细胞是否具有选择性作用。方法选用K562细胞及脐血CD34+造血干/祖细胞,加入不同浓度AST。MTT法检测药物对上述两种细胞增殖的影响;甲基纤维素半固体培养法考察AST对其体外扩增和多向分化能力的影响;以流式细胞术Annexin V-FITC-PI双染定量检测细胞凋亡率;Western blot方法检测BCR-ABL融合蛋白的表达。结果青蒿琥酯对K562细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用(P<0.01),并存在时效和量效关系,对集落抑制作用明显(P<0.01)。青蒿琥酯在12.5~25μg/ml作用48h对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用不明显(P>0.05),对集落生成亦无明显抑制作用(P>0.05)。经青蒿琥酯作用48h,K562细胞BCR-ABL蛋白以剂量依赖方式被降解(P<0.01)。结论青蒿琥酯在一定浓度范围内对K562细胞具有选择性抑制增殖和诱导凋亡的作用,对脐血CD34+造血干/祖细胞影响较小。

Flt3和c-kit在脐血CD34^+干/祖细胞中功能性表达及意义

为了解作用于早期造血的细胞因子受体Flt3和c-kit在脐血CD34^+造血干/祖细胞中的表达及功能,从蛋白和基因水平对其进行了研究。采用常规双色直接免疫荧光标记法,使用流式细胞术测定新鲜分离的和体外不同培养时间的脐血CD34^+造血干/祖细胞中Flt3和c-kit蛋白水平的表达,用RT-PCR法测定Flt3和c-kit的mRNA水平表达,并在体外对受体功能进行了探讨。研究结果显示,新鲜脐血CD34^+细胞中(68.8±15.4)％为Flt3^+,(50.6±12.7)％为c-kit^+,随着体外培养时间的延长,二者表达逐渐下降。结论:脐血CD34^+造血干/祖细胞在体外液体培养条件下Flt3和c-kit阳性表达可维持2-3周,其配体FL和SCF在培养的第1周内对细胞扩增效果最显著。

人类CD34^＋造血干／祖细胞的分子生物学特性

造血干／祖细胞（ＨＳＣ／ＨＰＣ）以有序的不同年龄等级结构状态存在于体内，它们的增殖、分化、成熟及程序死亡是一个连续的动态过程。ＣＤ３４抗原是目前所能认识表达在ＨＳＣ／ＨＰＣ表面上的最早抗原分子，对其分子结构的研究使人们更加认识到ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＨＰＣ的不同功能亚群、表达范围及其它生物学特征，诸如细胞周期状态、光散射性、造血生长因子受体（ＨＧＦｓＲ）Ｐ糖蛋白（Ｐｇｎ）或多药耐药基因（ＭＤＲ）的表达以及对活性染料的摄取等，从而完善并更新了现代ＨＳＣ的概念及正常造血调控的基本模式。

体外培养环境对脐血CD34^+造血干/祖细胞基因表达的影响

目的研究体外培养环境对脐血CD34+造血干/祖细胞基因表达的影响。方法脐血单个核细胞(MNC)在静态和动态培养系统中培养7d后,收集CD34+造血干/祖细胞,利用SMART-PCR技术从少量RNA中扩增cDNA用于标记探针,与基因芯片杂交后分析培养前后以及不同培养模式下培养的CD34+造血干/祖细胞基因表达的差异。结果在所检测的588个基因中,45个基因在培养前后的CD34+造血干/祖细胞中差异表达,其中20个基因在培养后表达上调,25个基因表达下调。另外,12个基因在不同培养模式中差异表达,只有CCL2在动态培养中高表达,而其余11个基因均在静态培养中高表达。结论通过分析体外培养环境对CD34+造血干/祖细胞基因表达的影响,可以在分子水平上理解CD34+造血干/祖细胞对培养环境的生理响应。

人造血干/祖细胞多态性的研究:Ⅲ.骨髓CD34^+造血干/祖细胞功能亚群的分析

CD 34^+造血干/祖细胞(HSC/HPC)是十分异质性的,由多个不同功能亚群所构成,在分化方向与重建造血等方面差异显著。本文对正常人骨髓CD 34^+ HSC/HPC各亚群进行了较全面的分析。首先以阳性选择策略,采用Isolex^(TM) 50免疫磁球分选术富集骨髓CD 34^+HSC/HPC,其纯度>90%,随之采用免疫荧光抗体双标记二维流式细胞仪对其测定,发现高纯度的CD 34^+HSC/HPC可分为八个不同亚群:1.CD 34^+/CD 71^-(23.4%—56.6%)与CD 34^+/CD 71^+(33.4%—66.6%);2.CD34^+/CD 45^-(80.8%—82.5%)与CD34^+/CD 45^+(8.1%—11.2%);3.CD 34^+/CD 33^-(20.4%—80.6%)与CD 34^+/CD 33^+(14.6%—64.8%);4.CD 34^+/DR^-(6.3%—11.0%)与CD 34^+/DR^+(82.8%—85.5%)。用免疫胶体金——免疫桥酶联组化双染色对上述亚群进一步分析的结果与流式细胞仪的高度一致。

脐血单个核细胞和CD34^+细胞体外扩增造血干/祖细胞

考察了脐血单个核细胞 ( MNC)和 CD3 4 +富集细胞在 SCF+IL- 3 +IL- 6 +FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性。实验发现 :CD3 4 +富集细胞具有很高的扩增潜力 ,通过 3周培养总细胞扩增了 ( 883 .2± 3 2 2 .4)倍 ,而 MNC仅扩增了 ( 5 3 .3± 6 .2 )倍。对比细胞集落生成和 CD3 4 +细胞的扩增发现 ,MNC的集落密度由最初的 ( 2 70 .9± 5 4 .9) CFCs/ 1 0 5cells上升至第 7天的( 1 496 .3± 41 7.7) CFCs/ 1 0 5cells,CD3 4 +细胞百分比则由最初的 ( 0 .99± 0 .1 8) %上升至第 7天的( 4.4± 1 .9) % ,而 CD3 4 +富集细胞在培养过程中 ,虽然集落总数和 CD3 4 +细胞总数始终呈上升趋势 ,但是其集落密度和 CD3 4 + 细胞百分比则始终呈下降趋势。在两种起始细胞培养中 ,CFU- GM(粒细胞 -巨噬细胞集落形成单位 )在集落中的含量逐渐增加 ,BFU- E(爆式红细胞集落形成单位 )含量则逐渐降低。在 3周的短期培养中 ,MNC可以得到更多的集落形成细胞 ( CFC)和 CD3 4

血管内皮生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞信号传导与转录活化因子的活化

目的通过对血管内皮生长因子(VEGF)诱导CD34+造血干/祖细胞内信号传导与转录活化因子(STAT)活化的研究,探索VEGF作用于CD34+造血干/祖细胞的分子机制及其信号传导途径。方法利用磁活化细胞分选系统(MACS)分离并纯化脐血CD34+造血干/祖细胞,体外以重组人细胞因子VEGF(50ng/ml)持续刺激不同时间(0,15,30,45,60,90min)后,提取细胞总蛋白,用Westernblot检测CD34+造血干/祖细胞内STAT-3和STAT-5磷酸化;免疫细胞化学鉴定CD34+造血干/祖细胞表面VEGF受体-2(VEGFR2)的表达,以及VEGF刺激不同时间后CD34+造血干/祖细胞内磷酸化STAT-3和STAT-5有无发生转核;采用能与VEGFR2特异性结合的七肽ATWLPPR封闭VEGF与VEGFR2的结合,Westernblot观察STAT-3和STAT-5的磷酸化是否被相应阻断。结果Westernblot检测结果显示,CD34+细胞在VEGF刺激下,STAT-3和STAT-5均发生了磷酸化,50ng/mlVEGF作用15min后,即可检测到磷酸化的STAT-3和STAT-5的表达,并分别在30和45min时达到峰值;之后开始下降,到90min时均已检测不到,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001)。免疫细胞化学显示VEGF能诱导磷酸化STAT-3发生转核并且在作用30min时最为显著,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001),而磷酸化STAT-5在VEGF刺激的各时间组均未出现明显的转?

房颤对外周血CD34^+造血祖细胞的影响及SDF-1/CXCR4在心房中的表达

目的:研究不同类型的房颤(AF)对人外周血CD34+造血祖细胞(CD34+HPCs)的影响,以及持续心房快速起搏犬心肌基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及其受体CXCR4的表达,初步探讨CD34+HPCs及SDF-1/CXCR4在AF时心肌损伤修复中的作用。方法:应用流式细胞术测定阵发性AF患者组(n=35)、持续性AF患者组(n=35)及窦性心律者对照组(n=30)外周血中CD34+HPCs的百分含量;并对持续性AF患者组中24例患者成功进行体外直流电复律后48 h,测定外周血中CD34+HPCs的百分含量。另外,将成年健康杂种犬13条随机分为两组:即快速起搏组(n=7)和假手术组(n=6),均开胸后于右心耳缝植AOO型起搏器,快速起搏组以400次/min起搏6周,假手术组不起搏。应用RT-PCR测定左心耳和左心房CXCR4 mRNA的表达水平,用蛋白质免疫印迹法检测左心房SDF-1蛋白的表达。结果:持续性AF患者组外周血中CD34+HPCs的百分含量明显高于阵发性AF患者组和对照组(P<0.05);而后两组间无差别。持续性AF患者成功进行体外直流电复律后48 h,外周血中CD34+HPCs的百分含量较复律前明显下降(P<0.05)。快速起搏组犬左心耳和左心房CXCR4 mRNA表达的水平明显高于假手术组(P<0.05),左心耳增高16.7%,左心房增高18.8%;SDF-1蛋白质表达的水平亦明显高于假手术组(P<0.01)。结论:持续性AF患者外周血中CD34+HPCs的数量增加;心房快速起搏犬心房SDF-1/CXCR4的表达增加。CD34+HPCs和SDF-1/CXCR4可能参与了持续性AF患者心房损伤时心肌组织的修复过程。

骨髓增生异常综合征CD34^+造血干祖细胞生物学特征研究进展

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性、克隆性造血干/祖细胞疾病。本文就MDS恶性造血克隆的起源、CD34^+造血干/祖细胞增殖动力学异常、凋亡异常及其机制、信号传导异常等作一综述。

健康人骨髓CD34^+造血干/祖细胞衰老与年龄的相关性研究

目的探讨增龄过程中健康人CD34^+造血干/祖细胞(CD34^+HSC/HPCs)衰老的变化过程。方法由重庆医科大学附属第一医院血液科骨穿室提供正常人骨髓9例,将其分为青年组3例(女性31岁、男性26岁、男性28岁)、中年组3例(男性59岁、男性57岁、女性52岁)和老年组3例(男性70岁、男性70岁、女性62岁)。提取骨髓单个核细胞(BMNCs)后,免疫磁性细胞分选法分离纯化CD34^+细胞群,流式细胞术检测细胞纯度,台盼蓝染色检测细胞活性,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察各年龄组阳性细胞百分比;造血干/祖细胞混合集落培养比较各年龄组CD34^+造血干/祖细胞形成混合集落能力。结果分选前每106个BMNCs中CD34^+细胞群比例为(1. 31±0. 54)%;免疫磁性分选后每106个细胞中CD34^+细胞群比例为(92. 5±0. 39)%。各年龄组人骨髓CD34^+造血干/祖细胞存活率可达99. 1%以上。人骨髓CD34^+造血干/祖细胞的SA-β-gal染色阳性率出现明显的随增龄变化趋势,老年组明显高于中年组及青年组。CD34^+造血干/祖细胞形成的干细胞混合集落能力随年龄增加降低。结论随年龄增加人骨髓CD34^+造血干/祖细胞出现明显衰老,表现为造血增殖能力下降,可能是造成一些老年人血液学疾病的原因。

CD34免疫亲合柱在脐血造血干祖细胞分离与扩增中的应用

目的 :观察CD34免疫亲合柱对脐血造血干 祖细胞分离纯化的效果及纯化后CD34+ 细胞的增殖分化特性。方法 :采用CD34免疫亲合柱分离脐血单个核细胞 (MNC)中的CD34+ 细胞 ,流式细胞技术 (FACS)进行细胞表面标志测定。将分离前后的细胞加入造血生长因子进行液态扩增培养和多向祖细胞集落 (CFU GEMM)培养。结果 :经CD34免疫亲合柱分离后脐血中CD34+ 细胞为 49 6 2 %± 17 6 9% ,明显高于脐血MNC(1 17%± 0 6 8% ) ,细胞回收率为 5 4 38%± 11 91%。分离后CD34+ 细胞和脐血MNC经造血生长因子刺激培养 2 0d分别扩增 5 6 1 0 0倍和 44 44倍。培养至 12d时 ,免疫亲合柱分离组CD34+ 细胞阳性率为 5 3 38% ,对照组为 7 91%。分离组CFU GEMM产率明显高于对照组 (P <0 0 0 1)。结论 :CD34免疫亲合柱应用于脐血造血干 祖细胞的分离可充分富集CD34+ 细胞 ,且分离后的CD34+ 细胞具有明显的增殖效应和CFU GEMM形成能力。

Puma表达下调对人脐血CD34＋造血细胞抗放射作用的初步研究

Puma属于BCL-2家族中BH3-only亚家族,动物和细胞研究发现其通过p53依赖和非依赖途径诱导细胞凋亡,并具有抗放射保护不增加肿瘤发生率的作用。本研究检测Puma基因敲降后对人脐血CD34+造血干祖细胞生物学功能的影响。应用RT-PCR、Western Blot检测Puma基因在辐射刺激条件下的表达,采用慢病毒感染人脐血CD34+细胞分选GFP+细胞,Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡,Ki67染色检测细胞周期,CCK-8、Brdu标记法检测细胞增殖能力,并进行集落形成实验(colony formig cell assay,CFC)。结果表明:Puma基因表达量随着射线强度的增加而增高,Puma基因表达下调抑制造血祖细胞体外集落形成能力和体外增殖能力。在辐射刺激条件下,抑制Puma基因表达可以减少人脐血CD34+细胞凋亡,维持细胞周期于G0期。结论:人脐血CD34+造血干细胞中Puma基因敲降具有一定的抗辐射作用,维持细胞于静息状态。

旋转壁式生物反应器中微囊化骨髓间充质干细胞支持造血干/祖细胞的体外扩增

为了构建一种新型的造血干细胞和基质细胞动态共培养体系,脐带血单个核细胞和包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(alginate-chitosan-alginate,ACA)微胶囊在旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel,RWV)中进行了7d动态悬浮共培养。培养液不含血清,补充多种生长因子(SCF50ng·mL-1,FL50ng·mL-1,TPO50ng·mL-1及IL-325ng·mL-1)。每24h进行总有核细胞计数,并测量培养液的pH和渗透压,在0h、72h和168h进行流式CD34+细胞分析以及集落形成能力检验。结果表明在RWV动态共培养过程中,培养液的pH保持在7.2~7.4,渗透压保持在280~310mmOsmol·kg-1,均适合造血干/祖细胞的体外扩增。经过7d的无血清动态共培养,总有核细胞、CD34+细胞以及混合集落(colony-formingunitsinculture,CFU-Cs)分别扩增了107.05±6.08,26.52±1.5和19.2±3.18倍。这种新型的动态微囊化共培养体系支持了造血干/祖细胞的大规模体外扩增,基质细胞抑制了造血干/祖细...

凋亡在脐血造血干/祖细胞冷冻损伤中的作用及其机制研究

为探讨脐血造血干 /祖细胞冷冻损伤中凋亡的作用及其机制 ,应用流式细胞术检测脐血CD34+ 细胞冻存前后细胞凋亡率、线粒体膜势能和Fas抗原 ,用免疫组织化学法检测Bcl 2蛋白表达 ,用Westernblot和caspase 3蛋白活性分析检测caspase 3的表达 ,以甲基纤维素半固体培养进行造血祖细胞集落分析。研究结果显示 ,CD34+ 细胞在 - 196℃冻存 2周或 4周后凋亡率增加 ,电泳出现DNA梯形条带 ,CFUs分别下降了 2 5 .2 %和 30 .1%。冷冻过程中细胞内线粒体膜势能下降 ,Bcl 2蛋白表达下调 ,而Fas抗原表达无明显改变。新鲜分离的CD34+ 细胞中caspase 3以分子量为 32kD的非活性酶原形式存在 ,冷冻过程中caspase 3被激活 ,可检测到分子量为 2 0kD的裂解片段 ,cas pase 3蛋白活性分别增加了 1.2倍和 1.5倍。结论 :凋亡在脐血造血干细胞冷冻损伤中起着重要作用 ,其机制可能是通过线粒体介导的caspase依赖性途径执行 ,caspase 3是其中一个重要的效应蛋白酶。

粒细胞集落刺激因子/粒-巨噬细胞集落刺激因子联合动员异基因造血干细胞移植

背景:目前FDA已批准应用于临床外周血造血干细胞移植的动员剂只有粒细胞集落刺激因子和粒-巨噬细胞集落刺激因子,其中粒细胞集落刺激因子单药应用是目前最主要的动员方案,但可引起供者骨骼肌肉酸痛、发热等不良反应。目的:回顾性分析以粒细胞集落刺激因子/粒-巨噬细胞集落刺激因子联合应用为动员方案的异基因造血干细胞移植临床效果。方法:选择2004-01/2009-10河南省人民医院血液科以粒细胞集落刺激因子与粒-巨噬细胞集落刺激因子联合应用为动员方案进行血缘全相合异基因造血干细胞移植51例,分析移植物成分、造血重建及移植物抗宿主病的发生率。结果与结论:动员96h后CD34+细胞占单个核细胞的比例为(0.97±0.13)%,CD34+CD38-细胞占CD34+细胞的比例为(37.49±4.03)%;移植后的快速造血重建与CD34+细胞、CD34+CD38-细胞输入量呈负相关。Ⅰ度、Ⅱ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病的发生率分别为25.5%,15.7%;局限性、广泛性慢性移植物抗宿主病的发生率分别为39.2%,21.2%。提示在血缘全相合异基因造血干细胞移植中,粒细胞集落刺激因子/粒-巨噬细胞集落刺激因子联合可有效实现干细胞动员,所获CD34+细胞完全可以满足快速造血重建的需要;输入较多的CD34+细胞、CD34+CD38-细胞可能利于快速造血重建。

造血干/祖细胞体外定向诱导分化为粒细胞的研究

为探讨利用人造血干 /祖细胞体外定向诱导分化的人粒细胞应用于临床大剂量放、化疗后预防感染的可行性 ,利用源自人胎盘脐带血的CD34+ 细胞及SCF ,IL 3 ,IL 6和G CSF的细胞因子组合的培养条件 ,体外进行向粒细胞的诱导分化。结果表明 ,在该体系条件下可诱导分化出约 1 0 0 0倍数量的细胞 ,流式细胞仪检测诱导效率可达 60 %以上 ,且诱导分化的细胞染色体未出现异常 ,裸鼠致瘤实验表明该细胞不具致瘤性 ,细胞体外生长 1 4 - 2 1天为高峰 ,33天后细胞不再增殖 ,且诱导分化出的细胞具有吞噬细菌的功能。结论 :利用细胞工程的方法体外“生产”出的粒细胞具有应用安全性 ,且具备生理状态下产生的此种细胞应具备的基本功能 。