内皮祖细胞CD34抗体包被冠脉支架对猪冠状动脉再狭窄影响的研究

目的探讨生物可降解高分子载内皮祖细胞CD34抗体支架是否可降低猪冠状动脉支架置入术后再狭窄。方法以生物可降解高分子聚乙二醇-聚乳酸-聚谷氨酸共聚物为载体,应用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)方法制成内皮祖细胞CD34抗体洗脱支架。18只猪随机分为三组,即紫杉醇支架组、CD34抗体支架组、裸支架组,每组6只,将紫杉醇支架、CD34抗体支架、裸支架分别植入到各组猪的冠状动脉损伤段,4w后处死,取出支架段血管行病理学观察及计算机图像分析血管管腔面积、内膜增生面积以及面积狭窄百分比。结果CD34抗体支架组内膜增生面积较裸支架组减低(P<0.05),紫杉醇支架组内膜增生面积较裸支架组也减低(P<0.05),但较CD34抗体支架组无明显差别(P>0.05)。结论生物可降解高分子载内皮祖细胞CD34抗体支架可明显加速支架置入术后血管内皮修复,降低再狭窄的发生。

雷帕霉素联合CD34抗体复合支架快速捕获外周血中内皮祖细胞

背景:临床用于治疗血管狭窄疾病的药物洗脱支架和单纯内皮修复型支架存在内皮化延迟和植入后再狭窄的问题。雷帕霉素联合CD34抗体复合支架可协同抵消抗增殖药物的内皮化延迟和内膜的过度增生,目前尚处于实验研究阶段。目的:观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架捕获内皮祖细胞能力及其所捕获内皮祖细胞的分化特征。方法:通过扫描电镜及间接免疫荧光观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架体外捕获外周血内皮祖细胞形态及其分化特征。通过荧光显微镜观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架植入兔耳动脉后捕获内皮祖细胞情况及支架片段的内皮化程度。结果与结论:扫描电镜观察到CD34抗体涂层支架可捕获直径6-8μm的纺锤状细胞,24 h时细胞变得充盈饱满。所捕获细胞具有内皮祖细胞的外形特征。间接免疫荧光观察CD34抗体支架表面可见大量血管内皮生长因子受体2阳性细胞黏附的红色荧光斑点。免疫荧光观察到CD34抗体涂层支架植入兔耳动脉24 h大部分被血管内皮细胞所覆盖,48 h达到完全覆盖,未见细胞异常聚集。结果表明雷帕霉素联合CD34抗体复合支架能特异性快速捕获外周血液中的血管内皮祖细胞,植入体内48 h即可完成血管内皮细胞覆盖,实现了支架快速内皮化,可促进内皮细胞修复。

血管内皮生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞信号传导与转录活化因子的活化

目的通过对血管内皮生长因子(VEGF)诱导CD34+造血干/祖细胞内信号传导与转录活化因子(STAT)活化的研究,探索VEGF作用于CD34+造血干/祖细胞的分子机制及其信号传导途径。方法利用磁活化细胞分选系统(MACS)分离并纯化脐血CD34+造血干/祖细胞,体外以重组人细胞因子VEGF(50ng/ml)持续刺激不同时间(0,15,30,45,60,90min)后,提取细胞总蛋白,用Westernblot检测CD34+造血干/祖细胞内STAT-3和STAT-5磷酸化;免疫细胞化学鉴定CD34+造血干/祖细胞表面VEGF受体-2(VEGFR2)的表达,以及VEGF刺激不同时间后CD34+造血干/祖细胞内磷酸化STAT-3和STAT-5有无发生转核;采用能与VEGFR2特异性结合的七肽ATWLPPR封闭VEGF与VEGFR2的结合,Westernblot观察STAT-3和STAT-5的磷酸化是否被相应阻断。结果Westernblot检测结果显示,CD34+细胞在VEGF刺激下,STAT-3和STAT-5均发生了磷酸化,50ng/mlVEGF作用15min后,即可检测到磷酸化的STAT-3和STAT-5的表达,并分别在30和45min时达到峰值;之后开始下降,到90min时均已检测不到,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001)。免疫细胞化学显示VEGF能诱导磷酸化STAT-3发生转核并且在作用30min时最为显著,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001),而磷酸化STAT-5在VEGF刺激的各时间组均未出现明显的转?

促红细胞生成素动员CD34^+内皮祖细胞治疗下肢严重缺血的临床研究

目的探讨促红细胞生成素(EPO)动员CD34^+内皮祖细胞(EPC)治疗下肢严重缺血的临床疗效。方法收治2014年1月至2015年6月共20例下肢严重缺血患者。皮下注射EPO前及后7天查外周血CD34^+EPC百分含量,随访6~18个月,随访内容包括:Wong-Baker FACES疼痛评分;溃疡愈合、皮肤营养状况;运动平板2.5km·h-1、10%坡度条件下最长无痛步行时间(Peak pain-free walkingtime,PPFWT);踝肱指数(Ankle-brachial index,ABI)。结果应用EPO后外周血CD34^+EPC百分含量明显增加(P<0.001),下肢溃疡愈合,无痛行走时间明显延长(P<0.001),踝肱指数明显增加(P<0.001)。Kaplan Meier法评估14个月保肢率为86%(95%可信区间为(0.61~0.96))。结论该研究显示应用EPO动员CD34^+内皮祖细胞治疗下肢严重缺血的方法是安全、有效的。

血管细胞外基质胶促进骨髓CD34+祖细胞分化为内皮细胞的实验研究

目的研究血管细胞外基质(ECM)胶促进骨髓CD34^(+)祖细胞分化为内皮细胞的作用。方法将人主动脉组织脱细胞后得到ECM,胃蛋白酶消化后得到ECM胶。HE染色和DAPI染色观察主动脉组织脱细胞效果。将小鼠骨髓CD34^(+)祖细胞分为2组:纤连蛋白(FN)组置于涂有FN的培养板中培养;ECM组置于板底铺有人主动脉ECM胶的培养板中培养。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD34^(+)祖细胞CD31、内皮型一氧化氮合酶(e NOS)及血管性血友病因子(VWF)mRNA表达;流式细胞术检测CD34^(+)祖细胞表面标志物CD31、CD144、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、CD133及CD45阳性细胞百分率;荧光显微镜下观察吞噬荧光素标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiIacLDL)的细胞数;蛋白芯片检测细胞分泌的促血管生成因子含量。结果DAPI和HE染色均显示人主动脉组织脱细胞前含有大量细胞核,而脱细胞后得到的血管ECM中不含细胞核。与FN组相比,ECM组CD34^(+)祖细胞CD31、eNOS及VWF mRNA表达升高,表达CD31、CD144及VEGFR2的阳性细胞率及吞噬Dil-acLDL的细胞数量增加,而表达CD133和CD45的阳性细胞率减少(P<0.05)。ECM组分泌血管生成素、成纤维细胞生长因子7、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、瘦素及血小板源性生长因子BB较FN组增多(P<0.05)。结论血管ECM胶可促进骨髓CD34^(+)祖细胞分化为内皮细胞,可能为心血管植入物原位内皮化提供新策略。

CD133免疫磁珠分选脐血内皮祖细胞的培养及鉴定

目的:建立具备高效增殖、血管生成与迁移能力的脐血内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)分离培养鉴定方法。方法:应用免疫磁珠分选纯化脐血单个核细胞中的CD133+细胞,体外EGM-2MV培养液培养扩增,通过形态学、细胞表面标志及细胞功能鉴定EPCs,并与脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)作比较。结果:EPCs分离培养7d左右开始出现小集落,21d左右集落扩大、相互融合,并呈现出典型铺路石样改变;培养14d左右,约90%的细胞免疫荧光Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双阳性,阳性率达90%。CD133和CD34阳性率从86.04%降至2.96%、90.88%降至2.99%,而CD31阳性率从1.12%升至99.88%。在增殖、血管生成与迁移能力上比较,EPCs明显优于HUVECs(P<0.05)。结论:通过CD133免疫磁珠分选脐血单个核细胞,可培养出具有高效增殖、血管生成与迁移能力的EPCs。

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(totalsaponins of panaxginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化。结果显示:10-70μg/mlTSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/ml效果最为明显。结论:合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。

人参总皂甙体外诱导CD34^+造血干/祖细胞增殖的作用

目的：探讨人参总皂甙(TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞(HSC/HPC)增殖的作用。方法：收集人脐血细胞,采用Stemsep TM干细胞分选系统分离纯化CD34^+HSC/HPC,经不同剂量TSPG加入不同造血生长因子组合进行培养,检测细胞总数、CD34^+细胞及集落形成细胞总数(CFCs)的变化。结果：TSPG 10、20、50和70μg/ml均可不同程度地提高细胞总数、CFCs和CD34^+细胞扩增倍数,TSPG 50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFCs和CD34^+细胞分别增至(2470．50±79．96)倍、(53．96±4．29)倍和(21．86士3．09)倍。结论：合适剂量的TSPG能够促进CD34^+造血干/祖细胞体外增殖。

体内外诱导CD34^+细胞生成血管内皮细胞的方法及其组织工程学运用

目的 本实验设计从骨髓中提取CD34 + 细胞作为血管内皮细胞干细胞 ,经诱导生成血管内皮细胞应用于组织工程学器官重建术。方法 利用免疫磁珠法从骨髓中提纯的CD34 + 细胞在体外经血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子 (bFGF)诱导 ;在动物实验中 ,CD34 + 细胞经Dil标记后于Matrigel混合涂于裸鼠背部皮肤缺损处 ,表面覆盖人胸膜组织。结果 细胞经诱导可转化生成血管内皮细胞 ,Ⅷ∶Ag、CD31+ 染色阳性 ,并可在重组基底膜 (Matrigel)中形成三维毛细血管网状结构。体内实验结果可见CD34 + 细胞参与并加速胸膜下毛细血管网形成 ,短时期内重建血供系统确保胸膜组织存活。对照组 (单纯覆盖Matrigel与胸膜 )胸膜缺血坏死。结论 可利用CD34 + 细胞替代毛细血管内皮细胞重建正常组织毛细血管网 ,与器官实质细胞共同组成复合组织 ,运用于组织工程化器官重建术 。

银屑病皮损区肥大细胞分布和血管内皮细胞CD34表达的研究论

目的:探讨肥大细胞(MC)和血管内皮细胞在银屑病发病中的作用。方法:采用组织化学和免疫组化的方法,观察寻常性银屑病皮损处MC和CD34标记血管内皮细胞的分布情况。结果:经甲苯胺蓝特殊染色发现,银屑病患者真皮区的MC密度在进行期(33.07±14.63)个/mm2,高于静止期(21.80±4.86)个/mm2,静止期又高于正常对照组(15.85±6.93)个/mm2,它们之间的差异均有显著性;免疫组化观察发现,银屑病真皮区CD34标记的微血管密度在进行期(29.31±4.04)个/mm2,明显高于静止期(22.31±2.07)个/mm2,而静止期又明显高于正常对照组(18.81±2.59)个/mm2。结论:寻常性银屑病皮损处真皮内肥大细胞和血管内皮细胞密度明显增加,且与病情变化有关。

增殖细胞核抗原在脐血CD34^+造血干/祖细胞中的表达及意义

目的 探讨增殖细胞核抗原 (PCNA)在脐血造血干 /祖细胞中的表达及意义。方法 采用流式细胞仪技术对不同培养时间和不同培养条件下脐血CD34+ 细胞中PCNA的表达水平和细胞周期进行了测定。结果 新鲜分离的脐血中CD34+ 细胞低表达PCNA ,阳性率为 (11 6± 5 2 ) % ,在体外短期培养 ,无细胞因子的组合PCNA表达逐渐下降 ,而在含有各细胞因子组合的培养体系中 ,PCNA表达水平明显增高 ,其中以SCF ,IL - 3,IL - 6 ,FL ,Tpo组合作用最显著 ,在培养第 7天时 ,PCNA蛋白表达率为 (78 2± 8 7) % ,且S/G2 /M期的细胞占 (5 9 8± 6 7) % ,明显高于培养前。结论 脐血CD34+ 细胞低水平表达PCNA ,造血生长因子对CD34+ 细胞的促增殖作用与上调PCNA蛋白的表达有关。

基于Gensini评分探究高血压患者内皮祖细胞CD_(34)^+与冠心病相关性

目的基于Gensini评分探究高血压患者内皮祖细胞CD+34与冠心病相关性,为高血压患者并发冠心病的预防提供依据。方法选取2012年8月-2013年11月于我院就诊的80例原发性高血压患者(EH),按是否患有冠心病分为高血压并发冠心病组(A组)46例和高血压未并发冠心病组(B组)34例,另选取20例正常无相关疾病者作为对照组(C组)。分析3组颈动脉的管壁厚度(IMT)、Gensini评分和EPCs CD+34水平及其与EH并发冠心病的相关性。通过彩色多谱勒超声仪诊断IMT,流式细胞仪检测内皮祖细胞CD+34水平。结果动脉IMT、Gensini评分,A、B、C 3组呈显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);EPCs CD+34A、B、C 3组呈显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。以EH并发冠心病为因变量,以动脉IMT、Gensini评分及EPCs CD+34为3个自变量,通过多元方程分析相关性,其中动脉IMT、Gensini评分均与EH并发冠心病呈正相关(P<0.05);EPCs CD+34与EH并发冠心病呈负相关(P<0.05)。结论Gensini评分、内皮祖细胞CD+34、动脉IMT均与高血压患者并发冠心病有相关性,因此将Gensini评分、内皮祖细胞CD+34、动脉IMT联合作为高血压患者对冠心病发病的预测因子的临床价值较高,诊断具有较高的准确性。

血府逐瘀汤对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠骨髓源内皮祖细胞衰老、迁移功能及miR-34a表达的影响

目的观察血府逐瘀汤对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)衰老、迁移功能及miR-34a表达的影响。方法体外培养EPCs,加入100 nmol/L AngⅡ诱导细胞衰老,建立内皮祖细胞衰老模型,随机分为正常组、模型组、miR-34a抑制剂组、5%血府逐瘀汤含药血清组(5%含药血清组)、10%血府逐瘀汤含药血清组(10%含药血清组)、15%血府逐瘀汤含药血清组(15%含药血清组)。β-半乳糖苷酶染色法检测内皮祖细胞衰老;Transwell小室检测EPCs迁移功能;qRT-PCR法检测miR-34的表达。结果与正常组比较,模型组EPCs衰老数量明显增多(P<0.01),EPCs的迁移数量减少(P<0.01),miR-34a表达量明显升高(P<0.01);与模型组比较,miR-34a抑制剂组和5%含药血清组、10%含药血清组、15%含药血清组EPCs衰老数量减少(P<0.01),EPCs的迁移数量明显增多(P<0.01),miR-34a抑制剂组和10%含药血清组、15%含药血清组中miR-34a的表达量降低(P<0.01);与miR-34a抑制剂组比较,5%含药血清组、10%含药血清组、15%含药血清组EPCs衰老数量增多(P<0.01),EPCs的迁移数量明显减少(P<0.01),miR-34a表达量明显升高(P<0.01);与5%含药血清组比较,10%含药血清组、15%含药血清组EPCs衰老数量明显减少(P<0.01),EPCs的迁移数量明显增多(P<0.01),miR-34a表达量明显降低(P<0.01);与10%含药血清组比较,15%含药血清组EPCs衰老数量明显减少(P<0.01),EPCs的迁移数量显著增多(P<0.01),miR-34a表达差异有统计学意义(P<0.01),3个含药浓度组比较,在不同干预时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论血府逐瘀汤能够延缓大鼠EPCs的衰老,促进EPCs迁移,下调miR-34a的表达。

内皮祖细胞CD34^+水平与高血压患者并发冠心病的相关性研究

目的研究内皮祖细胞(EPCs)CD34+水平与高血压患者并发冠心病(CHD)的相关性。方法将EH患者81例按照是否并发CHD,分为EH并发CHD组50例和EH未并CHD组31例,选取22例一切生理指标正常者为正常组。检测3组EPCs CD34+水平及颈动脉内膜中层厚度(IMT)。结果 EH并发CHD组患者的EPCs CD34+显著低于EH未并CHD组和正常组,而EH未并CHD组亦明显低于正常组;EH并发CHD组患者的动脉IMT水平显著高于EH未并CHD组和正常组,EH未并CHD组明显高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着病变程度加重,EPCs CD34+显著下降,动脉IMT显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 EH并发CHD患者的EPCs CD34+水平明显下降,二者呈相关性,且随着动脉狭窄程度的加重而呈显著下降,因此,将EPCs CD34+水平作为高血压患者并发冠心病的预测因子具有较大的意义。

单克隆抗体CD_(133)在内皮祖细胞表达的实验研究

目的研究CD133在内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)表面表达,为内皮祖细胞的鉴定提供依据。方法取兔髂骨骨髓,经密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞(mensenchymalstemcell,MSC),在血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等诱导条件下定向向内皮祖细胞分化,流式细胞仪检测不同时间内皮祖细胞CD133表达。结果定向诱导分化细胞形态学呈现“鹅卵石”样或“铺路石”样外观,流式细胞仪检测发现细胞表达CD133,并随时间推移表达逐渐下降。结论内皮祖细胞高表达CD133,与培养时间密切相关。

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。

人正常骨髓CD34^+造血细胞体外扩增形成红系及混合系造血祖细胞的能力

根据阳性选择策略，采用ＣＩＭＳ－１００免疫磁性无菌分离系统富集人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞，然后将其在含Ｅｐｏ＋ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－３＋ＩＬ－６＋ＳＣＦ（简ＥＧＩＳ）组合造血生长因子的无基质液培体系中扩增４周，定期进行单个核细胞计数、ＢＦＵ－Ｅ及ＣＦＵ－Ｍｉｘ的培养。经ＦＡＣＳ鉴定所富集的ＣＤ３４＋造血细胞纯度平均＞９０％。人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞在该条件下均可持续产生大量单个核细胞，最高可扩增１７７０倍。与ＨＰＰ－ＣＦＣ和ＣＦＵ－ＧＭ相反，ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｍｉｘ扩增量较低，最高仅为２．３６和２．４倍，且仅在第１周出现，随后迅速减少至停止。

实验性牙移动初期大鼠牙周组织CD133^+血管内皮祖细胞的表达

目的研究实验性牙移动初期大鼠牙周组织中CD133+血管内皮祖细胞(EPC)的表达。方法 40只Wistar大鼠,随机分为实验组和对照组,建立牙移动动物模型。于加力后1、3、5、7、14 d处死动物并制作以上颌第一磨牙为中心近远中向的组织切片,进行苏木精-伊红染色、CD133免疫组织化学染色。结果大鼠正常牙周组织中未见CD133表达的新生血管。实验性牙移动初期,实验组牙周组织新生微血管内皮细胞中可见CD133阳性染色,牙周组织CD133表达于加力后1 d达到高峰,此后逐渐下降,但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CD133+EPC参与了实验性牙移动牙周组织早期的血管改建,但其直接参与牙周组织血管生成较少,可能大多通过旁分泌作用参与新血管的形成。