用Midi MACS方法从白血病患者分选CD34^+/CD123^+细胞

本研究的目的是应用MidiMACS方法从急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞分选CD34+/CD123+细胞。首先,用淋巴细胞分离液从AML患者骨髓细胞分离单个核细胞(BMMNC),然后再通过MidiMACS方法相继分选出CD34+细胞,以及从CD34+细胞中分选出CD123+细胞并通过流式细胞术分析分选后细胞的富集度和回收率。结果显示:经过第一次分选后,CD34+细胞的富集度高达98.73%,平均为95.6%,其回收率最高可达到84.6%,平均为51%;第二次分选后,CD34+/CD123+细胞的富集度高达99.23%,平均约为83%;相对于分选前BMMNC而言,CD34+/CD123+细胞的回收率为34%,但相对于第一次分选后的CD34+细胞而言,其回收率为56%。结论:MidiMACS方法可用于AML患者骨髓CD34+/CD123+细胞的分选,分选后细胞的富集度和回收率与文献报道的通过FACS方法所获得的结果相类似。

CD34^(+)细胞数对单倍体造血干细胞移植治疗恶性血液病的影响

背景:单倍体造血干细胞移植与较高的植入功能不良相关,因此经常要求更高的CD34^(+)细胞数量,但现有研究关于异基因造血干细胞移植CD34+细胞剂量和研究终点关系的结论是有争议的。目的:探究CD34^(+)细胞数对单倍体造血干细胞移植治疗恶性血液疾病临床结果的影响。方法:纳入2019年1月至2021年12月期间于郑州大学第一附属医院造血干细胞移植中心行单倍体造血干细胞移植的恶性血液病患者,总计135例。结合既往研究结果及移植中心经验,以CD34+细胞数5.0×10^(6)/kg为截止点,将队列分为2组。评估两组的移植物植入情况、复发率及非复发死亡率、总生存期和无进展生存期等相关临床指标。结果与结论:①CD34+细胞剂量与血小板的植入相关,高剂量组血小板的植入时间早于低剂量组(14 d vs.16 d,P=0.013)。②两组患者3年总生存期无显著差异(67.5%vs.53.8%,P=0.257);两组间的无进展生存期也无显著性差异(65.6%vs.44.2%,P=0.106),但根据疾病风险指数(DRI)进行分层分析后发现低危患者高剂量组的3年无进展生存期较低剂量组升高(72.0%vs.49.3%,P=0.036)。③高剂量组3年累积复发率小于低剂量组(16.0%vs.33.5%,P=0.05)。④两组100 d内非复发死亡率高剂量组大于低剂量组,但无显著差异(17.3%vs.6.7%,P=0.070);进行分层分析发现,高危患者中高剂量组100 d内非复发死亡率明显高于低剂量组(20.0%vs.3.3%,P=0.046)。⑤综上所述,输注>5.0×10^(6)/kg的CD34^(+)细胞可促进血小板早期植入,可改善移植中低危风险患者的3年无进展生存期,并且降低移植后累积复发率;但在高危患者中,高剂量CD34+细胞导致移植后100 d内的非复发死亡率增高,考虑可能与移植后早期重度急性移植物抗宿主病的发生增多相关,因此考虑对回输高剂量CD34+细胞的患者应加强移植物抗宿主病的监测。

免疫磁珠分选白血病KG1a细胞中CD34^+CD38^-干细胞及其特性研究

目的从白血病KG1a细胞中分选CD34+CD38-干细胞并研究其生物学特性。方法免疫磁珠法分选CD34+CD38-细胞,流式细胞术分析细胞表面膜抗原、细胞周期,甲基纤维素培养体系观察其克隆性;以HL60、K562、CD34+CD38+细胞为对照,甲基偶氮唑蓝法检测柔红霉素对CD34+CD38-细胞的抑制作用;BALB/c裸鼠皮下接种,观察体内成瘤能力。结果分选的CD34+CD38-细胞纯度达95%以上,(69.03±3.25)%处于G0期,克隆形成率为(38.64±2.68)%,明显抵抗柔红霉素;不同浓度柔红霉素作用后,CD34+CD38-、CD34+CD38+、HL60、K562细胞的活性差异有统计学意义(F=961.136,P=0.000);CD34+CD38-在裸鼠皮下成瘤率显著高于CD34+CD38+细胞(P<0.05)。结论免疫磁珠法分选白血病干细胞简单易行,分选的细胞符合白血病干细胞生物学特性。

免疫磁性分选系统大量分选CD34^+细胞的实验研究

CD3 4 +细胞的分离纯化在自体外周血干细胞、异基因骨髓移植 /外周血干细胞移植及干细胞研究中具有重要的应用价值。为了摸索大量分选CD3 4 +细胞的方法 ,本研究应用Isolex3 0 0i磁性分选系统富集CD3 4 +细胞 ,采用流式细胞术监测分选前后细胞表面标志 ,经CD3 4 +细胞体外增殖实验及克隆形成实验验证分选获得的CD3 4 +细胞生物学活性。结果显示 ,所完成的 5例次自体外周血富集CD3 4 +细胞时 ,先收获单个核细胞约 ( 3 .5 -6.0 )× 10 10 ,CD3 4 +细胞占单个核细胞百分率为 ( 0 .5 5 - 1.2 ) % ;收获的CD3 4 +阳性细胞总数为 ( 2 - 3 )× 10 8,纯度为 ( 75 - 85 ) % ,回收率为 ( 4 0 - 65 ) %。体外实验表明 ,在SCF +IL 3 +FL +TPO +EPO存在下 ,经过 3 - 4天培养 ,可扩增 2 - 3倍 ;经CFU GM、BFU E集落形成实验显示具有形成集落的能力 ,证实分选后细胞具有造血祖细胞生物活性。结论 :应用Isolex3 0 0iCD3 4 +细胞分选仪可以高效大量富集CD3 4 +细胞 ,适于临床应用。

CD34^+细胞分选在异基因造血干细胞移植中的应用

CD34 +细胞分选可有效去除 T细胞 ,显著降低急慢性移植物抗宿主病 (GVHD)的发生率及严重度 ,对于植入率及疾病复发率无不良影响。随着 CD34 +细胞生物学特性研究的深入及其分离纯化技术的成熟 ,CD34 +细胞分选和移植的应用日益广泛 ,在拓宽供体来源 (HL A不全相合或半相合移植 )以及提高无关供体移植安全性等方面有良好的应用前景 ,但也存在着不少问题。本文就有关 CD34 +细胞移植中免疫活性细胞数量与移植效果、G- CSF(GM- CSF)和供体淋巴细胞输注的应用、移植并发症以及 HL A半相合 CD34 +细胞移植等问题作一综述。

免疫磁珠细胞术分选脐血CD_(34)^+细胞方法的改良

本研究采用免疫磁珠细胞术分选脐血CD+34 细胞 ,并对其方法进行改良。按CD34+细胞MACSReagents按试剂盒的操作方法 (旧方法 )分选 9例脐血标本 ,用改良后的方法 (新方法 )分选 1 0例脐血标本 ,每例标本均进行了两次分选。结果 ,旧方法于第一、二次分选CD34+细胞的分离率分别为 4 0 0± 5 0 %和 86 3± 5 2 % ,新方法于第一、二次份选中的分离率分别为 88 4± 1 5 9%和 92 4± 6 5%。旧方法与新方法在第一次分选CD34+细胞的分离率比较有显著性差异 (P <0 0 1 ) ,在第二次分选的比较无差异 (P >0 0 5) ,新方法第一、二次分选结果的比较无差异 (P >0 0 5)。结果表明 :采用新方法在第一次分选CD34+细胞的分离率就已达到旧方法第二次分选的效果 。

CD19^(+)CD24^(+)CD27^(+)调节性B细胞及IL-10、IL-34与系统性红斑狼疮中医证型的关系

目的:探讨CD19^(+)CD24^(+)CD27^(+)调节性B细胞(Bregs细胞)及白细胞介素(IL)-10、IL-34与系统性红斑狼疮(SLE)中医证型的关系。方法:选取2022年4月~2024年4月在本院接受治疗的117例SLE患者为研究组,并纳入同期进行体检的86名健康体检者为对照组,检测对比两组的CD19^(+)CD24^(+)CD27^(+)Bregs细胞中CD24^(high) CD27^(+)比例、CD24^(mid) CD27^(+)比例以及血清IL-10、IL-34水平。另将研究组根据中医辨证分型分为热毒炽盛证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证,检测对比不同中医证型患者间CD24^(high) CD27^(+)比例、CD24^(mid) CD27^(+)比例、IL-10、IL-34、肾功能及系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI)的差异。结果:研究组的CD24^(high) CD27^(+)比例、CD24^(mid) CD27^(+)比例、IL-10、IL-34水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。117例SLE患者中热毒炽盛证有49例、肝肾阴虚证33例、脾肾阳虚证35例。CD24^(high) CD27^(+)比例、CD24^(mid) CD27^(+)比例、IL-10、IL-34水平及SLEDAI评分均在肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、热毒炽盛证中依次上升,差异有统计学意义(P<0.05);脾肾阳虚证患者的血清肌酐、尿素氮、24h尿蛋白定量均高于热毒炽盛证及肝肾阴虚证患者(P<0.05)。结论:SLE患者血清CD19^(+)CD24^(+)CD27^(+)Bregs细胞、IL-10、IL-34水平均与中医证型有关,可作为中医辨证论治的辅助指标。

免疫磁珠法分选骨髓CD34^+细胞:纯度影响因素的分析

背景:免疫磁珠分选技术已成为分选CD34+细胞的主要方法之一,在长期实验中发现诸多因素影响其分离纯度,包括磁珠与细胞孵育时干冰与碎冰的使用、磁珠与细胞孵育及分离时摇床的摇摆方向、红细胞裂解液裂解单个核细胞的使用等。目的:在免疫磁珠分选CD34+细胞过程中分别对上述影响因素进行分析改进,以提高分选CD34+细胞的纯度。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-07/2009-03在太原市中心医院皮肤科实验室完成。材料:骨髓象筛选正常的人骨髓29份,由太原市中心医院血液科提供,取材均经患者同意。CD34+免疫磁珠为Dynal公司产品。方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离培养人骨髓单个核细胞,用免疫磁珠法分选骨髓CD34+细胞,对其分选过程中的主要环节如冰块与碎冰、摇床的种类以及红细胞裂解液的使用进行方法改进。方法1:按试剂盒提供方法进行磁珠常规分选CD34+细胞。方法2:在方法1基础上,用碎冰替代冰块进行磁珠与单个核细胞孵育。方法3:在方法2基础上,用万向摇床替代水平摇床。方法4:在方法3基础上,向单个核细胞中预先加入红细胞裂解液裂解残留红细胞。主要观察指标:通过流式细胞仪检测不同方法分选出的CD34+细胞纯度。结果:随着不同环节的逐渐改进,CD34+细胞纯度由(32.7±6.6)%升至(84.5±5.2)%,方法1,2,3,4所分选出的CD34+细胞纯度逐渐升高,组间方差分析差异显著(F=76.209,P<0.01),Bonferroni法两两比较差异亦有非常显著性意义(P<0.01)。结论:碎冰、万向摇床及红细胞裂解液的使用能有效提高免疫磁珠法分选人骨髓CD34+细胞的纯度。

免疫磁珠分离及流式细胞仪分选纯化外周血CD34^+/CD90^+干细胞

目的 建立人外周血CD34+ 细胞及其亚群的纯化分离方法。方法 用干细胞采集仪收集了 3例病人的外周血干细胞 ,应用免疫磁珠分离柱快速分离其中的CD34+ 细胞 ,随后采用分选型EPICSElite流式细胞仪进一步分选出CD34+ /CD90 + 双阳性早期造血干细胞。结果 免疫磁珠分离纯化后CD34+ 干细胞的纯度可达 83%～ 95 % ,回收率 5 4 %～ 71% ,活细胞率 >95 %。流式细胞仪分选后的CD34+ /CD90 + 细胞纯度可达 90 %以上 ,回收率在 4 0 %～ 5 0 % ,生存率 >95 %。起始标本中CD34+ 细胞含量越高 ,纯化所得到的干细胞纯度和回收率越高。两种纯化后的干细胞在形态学上有明显的不同。结论 联合应用免疫磁珠分离和流式细胞仪分选 ,可以较高的回收率快速纯化高纯度的CD34+

CD34^+细胞的心肌细胞分化潜能研究

目的 :了解粒细胞集落刺激因子 (G -CSF)动员的CD3 4 +细胞的心肌细胞分化潜能。方法 :用异丙肾上腺素 (ISO)复制急性心肌梗死大鼠动物模型 ,于 3h后用G -CSF动员骨髓造血干细胞进行心肌梗死动物模型的“自身干细胞移植” ,用免疫组化和HE染色方法检测动物模型心梗区的CD3 4 +细胞浸润以及心肌细胞再生情况。结果 :用ISO后 2 4h ,G -CSF处理组大鼠心梗区可见大量CD3 4 +单个核细胞浸润 ,并有CD3 4 +的新生心肌细胞生长 ,2周后疤痕组织不明显 ;而对照组心梗坏死区有大量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润 ,无CD3 4 +细胞浸润及新生心肌细胞生长 ,2周后出现较大量的疤痕组织。结论 :G -CSF动员CD3 4 +细胞具有向心肌细胞分化的潜能 ,用G -CSF动员造血干细胞的“干细胞自身移植” ,可治疗急性心肌梗死。

中剂量rhG-CSF对正常供者外周血CD34^+细胞动员效果

本研究探讨中等剂量600μg/d粒细胞集落刺激因子(GCSF)对正常供者CD34+细胞的动员效果及动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化。对2002-2004年我科31例健康供者给予rhGCSF600μg/d,在动员的第4天开始采集外周血干细胞(PBSC),并检测动员前后白细胞总数、动员后的有核细胞(NC)数、单个核细胞(MNC)数、CD34+细胞数及粒巨噬细胞集落形成单位(CFUGM),同时观察动员及采集过程中的不良反应。对12例供者GCSF动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化进行了观察。结果显示:600μg/d组与既往使用的300μg/d组相比,rhGCSF动员后的外周血细胞中NC、MNC和CD34+细胞及CFUGM显著增加(P<0.05),受者造血重建时间缩短(P<0.05),动员和采集过程中的不良反应发生率无明显上升(P>0.05),无严重不良反应发生。动员后CD3+细胞在PBMNC中的比例较动员前下降(15.05±3.3)%,(P<0.05)。动员前后CD4+/CD8+淋巴细胞的比值无明显变化(P>0.05)。结论:600μg/d的GCSF对正常供者的动员效果好,受者造血重建快,无严重不良反应发生。动员后PBMNC中CD3+细胞的下降及CD4+/CD8+淋巴细胞比值无明显变化,从而使得移植后急性GVHD的发生率无明显上升。

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(totalsaponins of panaxginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化。结果显示:10-70μg/mlTSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/ml效果最为明显。结论:合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。

人胎盘源贴壁细胞支持脐血CD34^+细胞体外扩增

从胎盘中分离培养人胎盘源贴壁细胞 (humanplacentaderivedadherentcells,hPDAC) ,研究其对脐血CD34+细胞体外扩增作用。以酶消化法自人胎盘组织中分离培养hPDAC ,并以流式细胞术对其进行鉴定。进一步 ,采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞 ,建立以hPDAC为滋养层的CD34+细胞体外扩增培养体系 ,并与无滋养层的液体培养体系相比 ,观察不同培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞百分率的影响。结果表明 ,人胎盘组织中可分离培养出hPDAC ,并证实其为混合性细胞群体 ,主要含有间充质细胞。以hPDAC为滋养层的共培养体系较无滋养层液体培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞均具有明显的扩增效应 ,其中以SCF +IL 3+IL 6 +FL +hPDAC组扩增效果最强 ,分别扩增了 ( 12 6 .0± 6 .7)倍 ,( 4 9.8± 1.7)倍和 ( 8.3± 1.6 5 )倍。上述结果提示 ,hPDAC具有体外支持造血作用 ,并提供了一与脐血CD34+细胞体外扩增相适应的新滋养层。

人脐血CD34^+细胞体外DEXTER基质细胞培养的动态观察

目的 动态观察人脐血CD3 4+ 细胞DEXTER基质细胞培养的情况。方法 应用MACS磁珠分离系统分离脐带血CD3 4+ 细胞 ,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养 ,观察不同时间、不同细胞因子组合基质细胞的生长状态。结果 SCF及SCF +BFGF组合可促进基质细胞集落的生成 ,脐血基质细胞在生长情况、组成成分、细胞形态等方面与骨髓基质细胞有不同的生物学特性。结论 脐血CD3 4+ 细胞在生长因子的辅助下能促进基质细胞集落的形成 ,有望成为新的基质细胞来源。

不同时相移植人骨髓间充质干细胞对人脐血CD34^+细胞植入NOD/SCID小鼠的影响

为了观察不同时相移植人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血(UCB)CD34+细胞移植的NOD/SCID小鼠造血重建的影响,明确最佳的移植时机,将体外培养扩增的人骨髓MSC分别于c细胞移植同时、移植前48小时及移植后48小时输入经60Coγ射线照射的NOD/SCID小鼠,观察共移植后42天内小鼠外周血白细胞和血小板变化,并于移植后42天处死小鼠,用FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量。结果表明:(1)MSC和UCB CD34+细胞同时输注可明显降低外周血白细胞和血小板下降幅度,缩短白细胞和血小板恢复时间;二者不同时输注均不降低白细胞和血小板下降幅度,且输注UCB CD34+细胞后48小时输注MSC时外周血血小板恢复时间明显晚于同时输注者。(2)与单纯UCB CD34+细胞移植相比较,不同时相输注MSC均可促进UCB CD34+细胞的植入,三个共输注组间促进骨髓各系造血植入效应无明显差异。结论:人骨髓MSC与UCB CD34+细胞共移植时,以同时移植效果最佳,此结果为MSC的临床应用提供了实验依据。

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34^+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响。结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P<0.01。MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P>0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P<0.01]。MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P<0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P<0.01]。MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率。当MSC与HFCL之比为4∶1时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为3∶2(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P<0.01]。结论:MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率。

血小板生成素对CD34^+造血祖细胞的协同扩增作用

血小板生成素(Tpo)是巨核细胞增殖分化和血小板形成的主要调控因子。为了探讨Tpo对CD34^+造血祖细胞的协同扩增作用,我们利用免疫磁珠分离系统(MACS)分选出90.11％-97.57％纯度的脐带血CD34^+细胞,在周的体外液体培养体系中,观察了Tpo与干细胞因子(SCF),IL-3,IL-6,红细胞生成素(Epo),粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)不同组合的扩增效率。结果表明,Tpo具有明显的协同扩增作用,细胞总数、集落形成细胞(CFC)和CD34^+细胞可分别被新增329.50±25.20倍,16.09±3.38倍和11.77±4.78倍,SCF+IL-3+IL-6+Tpo组的扩增作用最强,含Tpo实验组的扩增效率明显高于不含Tpo组;同时,含Tpo的组合还使CFU-MK,CD41a^+细胞,BFU-E和CFU-GM分别扩增了34.67±4.62倍,17.29±2.34倍,14.97±2.89倍和14.46±3.19倍。表明Tpo具有明显的扩增造血细胞的作用和刺激多系造血的活性。

体内外诱导CD34^+细胞生成血管内皮细胞的方法及其组织工程学运用

目的 本实验设计从骨髓中提取CD34 + 细胞作为血管内皮细胞干细胞 ,经诱导生成血管内皮细胞应用于组织工程学器官重建术。方法 利用免疫磁珠法从骨髓中提纯的CD34 + 细胞在体外经血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子 (bFGF)诱导 ;在动物实验中 ,CD34 + 细胞经Dil标记后于Matrigel混合涂于裸鼠背部皮肤缺损处 ,表面覆盖人胸膜组织。结果 细胞经诱导可转化生成血管内皮细胞 ,Ⅷ∶Ag、CD31+ 染色阳性 ,并可在重组基底膜 (Matrigel)中形成三维毛细血管网状结构。体内实验结果可见CD34 + 细胞参与并加速胸膜下毛细血管网形成 ,短时期内重建血供系统确保胸膜组织存活。对照组 (单纯覆盖Matrigel与胸膜 )胸膜缺血坏死。结论 可利用CD34 + 细胞替代毛细血管内皮细胞重建正常组织毛细血管网 ,与器官实质细胞共同组成复合组织 ,运用于组织工程化器官重建术 。