小白菊内酯抑制CD34^+CD38^-KG-1a白血病细胞的增殖并增强其被allo-NK细胞杀伤的敏感性

目的:探讨小白菊内酯(parthenolide,PTL)对CD34+CD38-KG-1a白血病细胞的增殖、Bcl-2表达及其被同种异体NK(allo-NK)细胞杀伤敏感性的影响。方法:免疫磁珠法从KG-1a细胞中分离CD34+CD38-KG-1a细胞。XTT法检测PTL对CD34+CD38-白血病细胞增殖的影响,Real-time PCR和Western blotting分别检测PTL对CD34+CD38-KG-1a细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达的影响,LDH释放法观察PTL对CD34+CD38-KG-1a细胞被allo-NK细胞杀伤敏感性的影响。结果:PTL对CD34+CD38-KG-1a细胞增殖的抑制呈剂量(2.5~80μmol/L)依赖性。PTL浓度为2.5μmol/L时,PTL组CD34+CD38-KG-1a细胞的增殖抑制率显著高于对照组[(4.89±1.07)%vs 0,P<0.01];PTL杀伤CD34+CD38-KG-1a细胞的IC50为20μmol/L;PTL组CD34+CD38-KG-1a细胞Bcl-2 mRNA[(0.105±0.007)vs(0.307±0.013),P<0.01]与蛋白表达均显著低于对照组。在效靶比为10∶1,20∶1和40∶1时,allo-NK细胞对PTL组CD34+CD38-KG-1a细胞杀伤率逐步升高,且均高于阴性(无PTL处理)对照组[(19.76±1.01)%,(30.14±0.96)%和(51.48±3.15)%vs(12.50±1.42)%,(16.90±0.93)%和(31.70±1.53)%(均P<0.01)];效靶比为40∶1时,allo-NK细胞对PTL组细胞的杀伤效率显著高于阳性(Bcl-2抑制剂ABT-737处理)对照组[(51.48±3.15)%vs(43.08±2.81)%,P<0.05]。结论:PTL能抑制CD34+CD38-KG-1a细胞的增殖并增强其被allo-NK细胞杀伤的敏感性,这可能与PTL下调Bcl-2的表达有关。

白藜芦醇对CD34^+CD38^- KG-1a白血病细胞凋亡的诱导作用

目的观察白藜芦醇(RES)诱导CD34+CD38-KG-1a白血病细胞凋亡的效应,初步探讨其作用机制。方法流式细胞术检测急性髓系白血病KG-1a细胞CD34和CD38的表达。以未加药物为对照,台盼蓝计数检测不同浓度(12.5、25.0、50.0、100、200μmol/L)RES对KG-1a细胞和外周血单个核细胞增殖的影响。选择KG-1a细胞抑制率约为50%的RES浓度作为后续实验的干预因素。AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞术检测RES诱导KG-1a细胞的凋亡效应,real-time RT-PCR检测RES对KG-1a白血病细胞Bcl家族抗凋亡Bcl-2/Bcl-xl基因和促凋亡基因Bid/Bax表达的影响,分光光度法检测RES对KG-1a细胞Caspase-3活性的影响。结果 KG-1a细胞中CD34+CD38-细胞比例占(90.23±2.57)%。RES能抑制KG-1a白血病细胞生长,呈浓度依赖性。25.0μmol/L RES对KG-1a细胞的抑制率约为50%,而该浓度对正常单个核细胞增殖无抑制作用。25.0μmol/L RES能诱导KG-1a细胞发生早期凋亡(AnnexinV-FITC+PI-)和晚期凋亡(AnnexinV-FITC+PI+)。25.0μmol/L RES作用后的KG-1a细胞,抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl表达下调,促凋亡基因Bid和Bax表达升高,Caspase-3活性增强。结论 RES能调节Bcl-2家族,诱导CD34+CD38-KG-1a白血病细胞凋亡。

脐血中CD34^+CD38^+细胞含量对急性白血病患者移植后造血重建的影响

为了探讨非亲缘脐血移植中CD34+ CD38+ 细胞回输量对造血重建的影响 ,采用流式细胞术分析复苏后的CD34+ CD38+ 细胞数 ,并对 2 0例急性白血病患者的体重、中性粒细胞 (ANC)和血小板 (Plt)恢复时间进行测定。结果表明 :2 0例接受的CD34+ CD38+ 细胞输入量为 (9.85 - 32 5 .71)× 10 4/kg ,其ANC恢复 >5× 10 8/L的中位时间为 18 5 (11- 32 )天。在 19例患者中Plt恢复 >2× 10 10 /L的中位时间为 4 5 (12 - 118)天。CD34+ CD38+ 细胞输入量与ANC和Plt恢复时间存在相关 ,r值分别为 - 0 .5 77(P <0 .0 1)和 - 0 .5 0 3(P <0 0 5 )。结论 :CD34+ CD38+细胞含量与造血恢复时间相关 ,足量输入CD34+ CD38+

microRNA在人脐血CD34^+CD38^-、CD34^+CD38^+细胞中的差异性表达

为进一步探讨microRNA(miRNA)在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞中的差异性表达。从人脐血中分离单个核细胞(MNC),应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果。结果发现,miRNA在人脐血CD34+CD38+细胞的表达水平比在CD34+CD38-细胞的表达水平降低至1/2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为"干细胞性"miRNA。经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个(14.29%,12/84)相同的miRNA。部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程。应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因。结论:"干细胞性"miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式→造血干/祖细胞基因表达谱→造血干/祖细胞的自我更新和系列定向分化。

脐血CD34^+CD38^-早期造血祖细胞的体外增殖和凋亡

为了从适龄产妇脐血中分离出CD34+CD38-细胞,在体外较长时间培养后观察分析CD34+CD38-细胞分 裂增殖、凋亡以及干细胞因子对CD34+CD38-细胞增殖的影响,用流式细胞仪从10例健康产妇脐血中分选出 CD34+和CD38-标记的脐血原始细胞,在添加IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、IGF-1和SCF 6种混合因子的干细胞培养基 中培养6个月,观察细胞并绘制生长曲线,用单细胞凝胶电泳检测干细胞因子对CD34+CD38-细胞生长的影响和 用流式细胞仪检测CD34+ CD38-细胞凋亡情况。结果表明:脐血CD34+CD38-细胞可在体外较长时间培养增殖, 无异常或过度的细胞凋亡发生。结论:通过控制培养条件,脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞可在体外较长时间 培养增殖,以作为大量脐血原始细胞移植的细胞来源。

慢性髓系白血病患者CD34^+ CD38^-细胞水平JunB和CDH13基因启动子区域的甲基化状态研究

慢性髓系白血病(CML)是骨髓造血干细胞恶性增殖的克隆性疾病,在CML患者细胞水平由于JunB和CDH13基因启动子区甲基化而使这2个抑癌基因的表达受损。为了探讨正常人和CML患者CD34+ CD38-细胞水平JunB和CDH13(cadhe rin-13)基因启动子区域甲基化状态及表达水平的差异,应用流式细胞仪分选出CD34+ CD38-细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测5例正常人和8例CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞JunB和CDH13基因启动子区域甲基化状态,用实时定量PCR(RT-PCR)检测JunB和CDH13基因的表达情况。结果表明:JUNB和CDH13基因在正常人骨髓CD34+ CD38-细胞中呈完全性非甲基化状态,CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞中JunB和CDH13基因启动子区甲基化比例分别为87.5%(7/8)和50%(4/8),明显高于正常人(p<0.05)。CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞中JunB和CDH13基因mRNA相对表达水平与正常人的相比明显降低(2-??CT分别为1/5.21和1/10.63)。结论:在CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞中JunB和CDH13基因启动子区域都发生了高度的甲基化,它们的mRNA表达水平也明显降低,JunB和CDH13基因启动子区域甲基化在CML的发病机制中起到一定的作用,甲基化检测对CML的靶向治疗及新的治疗方法具有重要意义。

脐血CD34^+细胞体外短期培养扩增研究

为寻找更有效的体外扩增脐血CD34 + 细胞的造血细胞因子组合 ,采集健康产妇脐带血 ,用免疫磁珠法分选CD34 + 细胞。采用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种具有早期作用的细胞因子的不同组合进行脐血CD34 + 细胞短期无血清液体培养 ,观察培养前后有核细胞、CD34 + 细胞、CD34 + /CD38- 细胞、CFU GEMM、CFU GM和BFU E数量的变化。结果在 3种不同的细胞因子组合中 ,同时应用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子培养 7d的扩增效果最好。突出的发现是在这种条件下CD34 + /CD38- 细胞亚群达到平均 1 97.9倍的扩增效果。提示 :SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子是脐血CD34 +

CD34^+CD38^+造血干细胞移植MISTRG小鼠的人源化免疫特征研究

目的研究人脐带血CD34^+CD38^+造血干细胞移植入MISTRG免疫缺陷小鼠体内的人源化免疫特征。方法利用Ficoll密度梯度离心法从新生儿脐带血中分离单个核细胞,并结合免疫磁珠法分选hCD34^+造血干细胞,然后经体外扩增培养后利用流式细胞技术检测CD34^+CD38^+细胞的比例。取2×105细胞数注射至辐照后的新生MISTRG小鼠肝脏内,分别于第3、6、9、12周采血检测人源免疫细胞的分化与表达情况。结果免疫磁珠法分选人的CD34^+CD38^+造血干细胞纯度高达92.0%。移植小鼠外周血中的hCD45^+细胞初始浓度水平大于10.0%,淋巴细胞群包含人源T(hCD3^+CD45^+)、B(hCD3-CD19^+)和NK(hCD3-CD56^+)淋巴细胞,其中B(hCD3-CD19^+)淋巴细胞所占比值最大(初始水平为49.0%±7.4%),髓系细胞群则主要由巨噬细胞组成(初始水平为82.3%±4.5%)。小鼠外周血中hCD45^+细胞比值和T细胞占免疫细胞的比值随着时间的推移逐渐下降,B淋巴细胞和巨噬细胞所占的比例逐渐升高,而NK细胞基本完全消失。结论人源CD34^+CD38^+造血干细胞在新生MISTRG小鼠中可有效分化为人源淋系和髓系免疫细胞。在移植后的12周内hCD45^+细胞的比例逐渐下降,MISTRG免疫缺陷小鼠最佳的人源化免疫系统维持时间为第3～6周。

CD34^+CD38^-KG1a白血病干细胞对同种异体自然杀伤细胞的抵抗作用及其机制

目的探讨CD34^+CD38^-KG1a白血病干细胞抵抗同种异体自然杀伤(NK)细胞杀伤作用的机制。方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34^+CD38^-KG1a细胞和4例健康个体外周血中NK细胞,并采用流式细胞术检测纯度;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞在不同效靶比(5∶1,10∶1,20∶1)下对K562和CD34^+CD38^-KG1a细胞的杀伤作用;聚合酶链式反应-序列特异性引物法分析NK细胞KIR和CD34^+CD38^-KG1a细胞HLA-Ⅰ基因分型;流式细胞术检测K562和CD34^+CD38^-KG1a细胞表面主要组织相容性复合体(MHC)-I类链相关分子A/B、人巨细胞病毒UL16结合蛋白(ULBP)1~3和人类白细胞抗原(HLA)-Ⅰ类分子的表达。结果分选的CD34^+CD38^--KG1a细胞和NK细胞纯度分别为(94.25±2.16)%、(91.70±2.05)%。NK细胞在各效靶比下对CD34^+CD38^-KG1a细胞的杀伤率均低于K562细胞(P<0.05)。4例健康个体NK细胞KIR基因型为KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2,CD34^+CD38^-KG1a细胞HLA-Ⅰ基因型为A30、30,B51、78,Cw4、16。K562细胞高表达NKG2D配体,CD34^+CD38^-KG1a细胞几乎不表达NKG2D配体,CD34^+CD38^-KG1a细胞中NKG2D配体表达率显著低于K562细胞(P<0.05);K562细胞中几乎不表达HLA-Ⅰ,CD34^+CD38^-KG1a细胞高表达HLA-Ⅰ,CD34^+CD38^-KG1a细胞中HLA-Ⅰ的表达率显著高于K562细胞(P<0.05)。结论CD34^+CD38^-KG1a细胞明显抵抗同种异体NK细胞的杀伤作用,其机制可能与高表达HLA-Ⅰ分子和低表达NK2D配体有关。

流式细胞检测术分析胎肝CD_(34)^+细胞成分

目的 了解胎肝中CD3 4 + CD3 8+ 和CD3 4 + CD3 8-细胞数量组成。方法 从胎肝中分离细胞 ,制成细胞悬液 ;经淋巴细胞分离液密度梯度离心 ,收集单个核细胞 ;洗涤两次 ,制备细胞母液 ;取约 1× 10 6细胞经CD3 4 CD3 8荧光抗体标记 ,流式细胞仪检测CD3 4 + CD3 8+ 和CD3 4 + CD3 8-细胞含量 ;用红细胞裂解液裂解残留在MNCs中的红细胞 ,统计肝细胞中MNCs的相对总数 ,最终统计出胎肝中CD3 4 + 和CD3 4 + CD3 8-细胞的相对数量。结果 2 2～ 30W胎龄胎肝MNC中CD3 4 + 细胞平均为 12 .0 2 %± 4 .0 0 % ,CD3 4 + CD3 8-细胞平均为 6 .17%± 5 .0 8% ,CD3 4 + CD3 8-细胞在CD3 4 + 细胞中约占 5 1.0 0 %± 32 .5 6 % ;该期胎肝组织中CD3 4 + 细胞和CD3 4 + CD3 8-细胞相对总数和胎龄有一定的相关性 ,30W时明显高于 2 2W。结论 2 2～ 30W胎龄胎肝中的CD3 4 + 细胞和CD3 4 + CD3 8-细胞相对百分率都高于胎儿脐血、新生儿脐血、成人骨髓和外周血的百分率 ;CD3 4 + CD3 8-细胞在CD3 4 +

CD7阳性急性髓系白血病骨髓干/祖细胞5个基因表达的研究

本研究探讨abca5、mdr-1、kdr、dapk和irf-15个基因在CD7'急性髓细胞性白血病干/祖细胞的表达。利用实时定量RT-PCR(RQ-PCR)方法检测了15例正常骨髓(NBM)和16例AML患者骨髓单个核细胞(MNC)中5个基因的表达。采用流式细胞仪(FCM)分选8例NBM和21例AML患者骨髓CD34'CD38+祖细胞和CD34+CD38-干细胞,利用微量细胞RQ-PCR方法检测分选细胞中5个基因的表达。结果表明:NBMMNC均表达这5个基因,其中irf-1与dapk表达水平最高,相对表达量分别为4.08和3.86;abca5和mdr-1表达水平较低,为0.49和0.84;kdr表达最低为0.02。在经分选的CD34'CD38+祖细胞中,dapk和irf-1表达明显减低(p<0.05),kdr表达明显增加(P<0.05),其余2个基因无明显变化。在CD34'CD38-Lin-干细胞中,5个基因的表达均高于CD34+CD38+祖细胞,普遍增加至近2倍,而kdr增加了3倍,其中kdr和irf-1表达的增加具有统计学差异(P<0.05)。与NBM相比,AMLMNC中5个基因的表达水平均有不同程度减低,以abca5、mdr-1、kdr和dapk最为显著(p<0.05)。与AMLMNC相比,AMLCD34+CD38+细胞中,irf-1和dapk表达明显减低(p<0.05),其余3个基因表达增加,以kdr表达增加有统计学意义(p<0.05)。AMLCD34+CD38+与CD34+CD38-细胞比较,发现5个基因在CD34+CD38-细胞中的表达均增加,尤以kdr和irf-1的表达增加有意义(p<0.05)。AMLCD34+CD38-CD7+细胞与CD34'CD38-CD7-细胞中5个基因的表达均比CD34'CD38'细胞中的高,其中只有CD34'CD38-CD7+细胞中KDR和CD34'CD38-CD7-细胞中KDR和irf-1的表达增加并具有统计学差异(P<0.05)。结论:NBM中kdr主要表达在干/祖细胞中,而dapk和irf-1主要表达在较分化的细胞中。5个基因在干细胞阶段的表达均高于祖细胞阶段。AMLCD34+CD38-CD7+细胞与CD34+CD38-CD7-都具有干/祖细胞的基因表达特点。

共刺激分子CD28和B7在胃肠道肿瘤的表达

目的检测胃肠道肿瘤患者外周血中CD28+T细胞数量及原代细胞表面B7表达水平,以探讨胃肠道肿瘤患者共刺激通路是否异常。方法采用流式细胞术检测胃肠道肿瘤患者外周血中CD28+T细胞与胃肠道肿瘤患者原代细胞B7分子表达,并与胃肠道良性疾病进行比较。结果胃肠道肿瘤患者CD28+T细胞数明显低于对照组(P<0.01);其原代细胞表面B7-1、B7-2表达水平低于对照组(P<0.01)。结论胃肠道肿瘤患者外周血T细胞低表达CD28分子,胃肠道肿瘤细胞低表达B7分子,从而影响B7-CD28共刺激通路,使T细胞不能有效地清除肿瘤。

Tpo、IL-11基因修饰的基质细胞对CD_(34)^+CD_(38)^-早期造血祖细胞扩增的影响

目的 观察经Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞对脐血CD3 4 + CD3 8-细胞体外扩增的影响。方法 用载有Tpo、IL 11基因的重组逆转录病毒感染成纤维样基质细胞HFCL ,通过Northernblot法检测基因修饰的HFCL细胞Tpo、IL 11基因的表达。以未经基因修饰的HFCL细胞作为对照 ,将脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞在这种基因修饰的HFCL细胞支持下 ,进行 7d体外扩增后 ,用锥虫蓝拒染法计数活细胞总数 ,并用流式细胞仪分析扩增细胞中CD3 4 + 细胞以及CD3 4 + CD3 8-细胞的比例。结果 在Tpo基因修饰的HFCL细胞、IL 11基因修饰的HFCL细胞和Tpo +IL 11基因共同修饰的HFCL细胞的支持下 ,扩增后CD3 4 + CD3 8-早期造血祖细胞的比例分别为 (1.8± 0 .2 4 ) %、(1.6 2± 0 .2 3) %、(2 .4 5±0 2 8) % ,细胞扩增倍数为 4 .2倍、3.6倍、6 .9倍 ,高于对照组的 (0 .80± 0 .2 3) %和 1.5倍 ,同时扩增细胞总数和CD3 4 + 细胞比例亦高于未经基因修饰的HFCL细胞所支持的扩增体系。结论 Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞可有效促进脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞体外扩增 ,同时能有效维持扩增体系中的CD3 4 + CD3 8-细胞以及促进其扩增。

人脐血CD34^+ CD38^-细胞免疫表型和染色体核型特征分析

目的分离脐血干/祖细胞(CD34+CD38-)进行体外长期培养,观察分析其增殖、细胞表面分子标志和染色体核型的特征。方法用流式细胞仪分选CD34FITC和CD38PE标记的CD34+CD38-脐血原始细胞,在含细胞生长因子IL3、IL6、GMCSF、EPO、SCF和胰岛素样生长因子的干细胞培养基中培养6个月,用流式细胞术检测体外培养30d的干/祖细胞表面标记,并用G显带方法分析其染色体核型。结果在一定培养条件下,经7～12d培养,脐血干/祖细胞(CD34+CD38-)开始增殖。培养6个月后,每孔接种1个细胞,细胞数增殖至250～350个;每孔接种10个细胞,细胞数可增殖至400～500个。每孔接种1个细胞其细胞增殖峰持续时间(8～9代)比接种10个细胞(6～7代)长。经体外长期培养增殖,细胞仍强烈显示干/祖细胞表面分子标记(CD34+CD38-);细胞染色体数目、结构未见异常。结论脐血干/祖细胞(CD34+CD38-)经体外特异性培养增殖,可为大量脐血干/祖细胞移植提供细胞来源。

人脐血间充质干细胞对脐血CD_(34)^+细胞体外扩增作用的研究

目的探讨含人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)体系在体外对脐血造血干细胞(HSCs)扩增作用。方法(1)用含人脐血MSCs及不同造血生长因子(HGFs)组合的无血清扩增体系对人脐血CD+34细胞进行体外扩增。(2)于扩增前及扩增后第6、12天分别用双色流式细胞仪动态检测HSCs表面抗原标记:CD+34、CD+34CD-38、CD+34CD+3、CD+34CD+19、CD+34CD+33和CD+34CD+41a细胞的含量。(3)按本实验室方法行体外半固体培养,观察扩增前后脐血细胞粒单核细胞集落形成单位(CFUGM)、爆式红系集落形成单位(BFUE)、混合集落形成单位(CFUMix)及高增殖集落形成单位(CFUHPP)集落形成情况。结果(1)含人脐血MSCs体系对脐血CD+34CD38细胞的扩增倍数在第6天和第12天分别为159和437倍。该亚群百分比在单纯因子组扩增第12天时为1.98%,而在含脐血MSCs组为9.98%,明显高于扩增前。(2)集落培养表明,含脐血MSCs组扩增第12天与扩增第6天相比,其CFUMix和CFUHPP的扩增倍数增加,而单纯因子组这两种集落的扩增倍数下降。(3)随扩增天数的增加,两组扩增体系中CD+34CD+3和CD+34CD+41a细胞均明显增加,而CD+34CD+19和CD+34CD+3细胞均明显减少。两组相比,含脐血MSCs组差异更显著。结论(1)含脐血MSCs体系不仅能扩增更原始的造血干/祖细胞(HSPC),且具有在短期内(12d)保持HSCs不耗竭。(2)含脐血MSCs体系对脐血CD+34细胞向定向祖细胞的扩增,主要为髓系及巨核系祖细胞,而对其向淋巴系祖细胞的扩增具有抑制作用。

免疫磁珠分选系统在急性髓系白血病干细胞分离中的应用

目的:采用免疫磁珠分选系统(MACS)分离人白血病骨髓CD34+、CD38-干细胞群。方法:收集人白血病骨髓,Percoll密度梯度离心分离单个核细胞,CD34、38磁性标记,MACS分离纯化CD34+、CD38-干细胞群,流式细胞仪检测其纯度和分选前后CD34+、CD38-百分比,计算回收率。结果:分选后的CD34+、CD38-细胞纯度达72.6±3.2%,回收率85.8±1.2%。结论:免疫磁珠分选系统是一种有效的白血病干细胞分离提纯方法,所得细胞纯度比较高。

白血病干细胞免疫表型与急性白血病疗效及预后的关系

研究表明，白血病细胞中的CD34＾＋CD38＾-CDl23＾＋亚群［1］和CD34＾＋CD38＾-CD96＾＋亚群［2］同样具备白血病干细胞（LSC）的特性。但是，目前为止，还没有哪个表面标志是公认的LSC特异标志，如何准确界定LSC仍然是研究的难点和热点。LSC表面标志对白血病疗效和预后判断的作用如何？