CD36/Src/ERK通路参与单核细胞向巨噬细胞的分化

目的:探讨脂肪酸转位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)在单核细胞向巨噬细胞分化中的作用。方法:采用不同浓度(0、100和200μg/L)佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导人源单核细胞THP-1向巨噬细胞分化;用CD36小片段干扰RNA(CD36 small interfering RNA,siCD36)干扰THP-1细胞CD36的表达;又用CD36 cDNA的重组慢病毒转染THP-1细胞,构建CD36过表达细胞系。显微镜下观察细胞形态;结晶紫染色法检测细胞黏附能力;流式细胞术和Western blot检测细胞分化过程中CD36的蛋白表达,real-time PCR检测CD36、CD11b和CD80的mRNA水平。Western blot检测THP-1细胞向巨噬细胞分化过程中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和Src酪氨酸激酶的表达。结果:THP-1细胞向巨噬细胞分化的过程中,CD36表达增加(P<0. 01)。与正常细胞相比,siCD36干扰细胞的表面积减小,黏附能力降低(P<0. 01),细胞中CD11b和CD80的mRNA水平下降(P<0. 01);而CD36过表达细胞的表面积明显增大,黏附能力增强(P<0. 05),且细胞中CD11b和CD80的mRNA水平升高(P<0. 01)。THP-1细胞向巨噬细胞分化过程中,ERK的磷酸化明显增加,而siCD36干扰的THP-1细胞分化过程中ERK的磷酸化和Src的磷酸化则明显减少(P<0. 05)。结论:CD36通过增强Src磷酸化从而促进ERK的磷酸化及活化,最终促进THP-1细胞向巨噬细胞分化。

锌指蛋白-36缺陷抑制小鼠的成骨细胞分化:基于激活ERK/ MAPK通路

目的探究锌指蛋白-36(ZFP36)对成骨细胞分化的调控作用及机制。方法通过提取小鼠原代骨髓间充质干细胞,结合小鼠成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1,在体外成骨分化诱导状态下观察Zfp36(编码ZFP36)的表达变化。通过干扰RNA技术构建Zfp36缺陷的细胞,观察成骨分化作用的改变。通过第二代转录组测序技术探究Zfp36缺陷细胞成骨分化过程中的转录组水平改变。通过ERK/MAPK信号抑制分子U0126验证Zfp36缺陷对成骨分化作用的调控机制。结果小鼠原代骨髓间充质细胞以及MC3T3-E2细胞中Zfp36表达在成骨分化0~14d过程中呈逐渐升高趋势,在第7天到达峰值时较第0天升高3.85倍(P<0.0001)。抑制上述细胞Zfp36的表达后,成骨分化过程中碱性磷酸酶染色及茜素红染色弱于对照组,成骨分化标志基因Alpl(P<0.01)、Sp7(P<0.001)、Bglap(P<0.01)、Ibsp(P<0.0001)表达显著减弱。转录本测序结果提示Zfp36缺陷细胞的下调基因富集到骨矿化相关基因集中,且与ERK信号相关。蛋白表达检测显示Zfp36缺陷细胞的磷酸化ERK蛋白比例较对照组升高2.1倍(P=0.0274)。通过分子化合物U0126抑制Zfp36缺陷细胞中被激活的ERK/MAPK信号,可观察到表型挽救现象,并且呈剂量依赖。Zfp36缺陷细胞在10μmol/L度U0126作用下碱性磷酸酶染色增强,成骨细胞分化标志基因Runx2(P<0.05)及Bglap(P<0.05)表达显著增高。结论ZFP36参与了小鼠成骨细胞的分化调控过程,Zfp36缺陷会引起ERK/MAPK信号通路的激活,进而抑制成骨细胞向骨细胞的分化。

CD36和胞外信号调节激酶通路在脂多糖诱导炎症因子中的作用研究

本研究以鼠源巨噬细胞RAW264.7为模型,研究CD36和胞外信号调节激酶(ERK)通路对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞分泌炎症因子的影响。首先用100ng/ml LPS刺激正常及小干扰RNA(siRNA)技术沉默CD36表达的巨噬细胞16h,检测巨噬细胞的ERK活性及分泌炎症因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和IL-10的水平;继而以20nmol/L ERK抑制剂处理细胞,再用LPS刺激,检测以上各项指标的变化,进一步明确ERK通路与LPS诱导巨噬细胞分泌炎症因子的相关性。结果显示,经LPS刺激,巨噬细胞的ERK活性显著增强,分泌的促炎因子TNF-α和IL-6显著增高,抑炎因子IL-10水平无明显变化;与CD36正常表达的巨噬细胞相比,CD36表达下降的巨噬细胞ERK活性及促炎因子TNF-α、IL-6水平显著下降,抑炎因子IL-10显著增多。与未处理组相比,ERK抑制剂预处理的巨噬细胞中LPS诱导的ERK活性显著降低,促炎因子TNF-α和IL-6水平降低,抑炎因子IL-10水平升高。结果提示,LPS能通过其受体——CD36,激活巨噬细胞内ERK活性,进而促进巨噬细胞促炎因子的分泌。

CD36在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及调控Wnt/β-catenin信号通路对人肾小管上皮细胞增殖凋亡的实验研究

目的:探讨CD36在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及调控Wnt/β-catenin信号通路对人肾小管上皮细胞增殖凋亡的影响。方法:Western blot检测CD36在糖尿病肾病中的表达;CD36小干扰RNA(CD36-siRNA)和阴性对照(siRNA-NC)转染人肾小管上皮细胞HKC,以空脂质体转染的细胞作为对照组,Western blot检测转染48 h后各组细胞中CD36蛋白表达;将后续实验分为低糖组、高糖组、siRNA-NC+高糖组、CD36-siRNA+高糖组,各实验组细胞培养48 h后,CCK8试验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl2-Associated X的蛋白质(Bax)、p53、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表达。结果:CD36在糖尿病肾病的表达显著高于正常肾组织(P<0.01);CD36-siRNA组CD36蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.01);高糖组细胞存活率及Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于低糖组,细胞凋亡率及Bax、p53蛋白表达显著高于低糖组(P<0.01),siRNA-NC+高糖组细胞存活率、细胞凋亡率及Bcl-2、Bax、p53、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与高糖组比较差异无统计学意义(P>0.05);CD36-siRNA组细胞存活率及Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著高于高糖组,细胞凋亡率及Bax、p53蛋白表达显著低于高糖组(P<0.01)。结论:CD36在糖尿病肾病中高表达,高糖能抑制人肾小管上皮细胞HKC的增殖,促进细胞凋亡,而沉默CD36基因的表达能减弱这种效果,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。

肺炎衣原体对SR-A1和CD36表达的影响及相关信号机制研究

目的:探讨肺炎衣原体(Cpn)对THP-1源性巨噬细胞A1型清道夫受体(SR-A1)和B类清道夫受体CD36表达的影响及c-jun氨基端激酶(JNK)信号通路在其中的调控作用。方法:THP-1单核细胞诱导分化为巨噬细胞后随机分为四组:对照组、Cpn组、Cpn+SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SP600125组。运用油红O染色观察细胞浆内脂滴的变化,用酶荧光学法检测细胞内胆固醇酯含量的变化,分别用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测各组SR-A1、CD36mRNA和蛋白表达。结果:SP600125能呈浓度依赖性的抑制Cpn诱导的泡沫细胞形成和SR-A1表达上调,但对Cpn诱导的CD36的表达无明显影响。结论:Cpn可通过JNK信号通路上调SR-A1表达,而Cpn对CD36表达无明显影响。

吡啶羧酸铬通过AMPK信号通路促进3T3-L1脂肪细胞脂肪酸转位酶CD36的转位

目的研究吡啶羧酸铬(CrPic)对3T3-L1脂肪细胞脂肪酸转位酶CD36转位的作用及机制。方法采用3T3-L1脂肪细胞作为模型,通过免疫荧光及Western blot等方法观察CrPic及胰岛素对CD36转位的作用;并在此基础上,探讨CrPic对CD36作用的分子机制。结果免疫荧光结果显示CrPic和胰岛素可促进3T3-L1脂肪细胞的CD36从胞质转位到胞膜;Western blot结果表明脂肪细胞胞膜上CD36的含量也增多。给予腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路抑制剂compound C之后,CrPic促进CD36转位的作用消失,但胰岛素的作用却不受影响。结论 CrPic通过AMPK信号通路促进3T3-L1脂肪酸转位酶CD36的转位。

消癥通络法调节PPARγ相关通路干预动脉粥样硬化的实验研究

目的:通过动脉硬化ApoE^(-/-)小鼠实验,探讨消癥通络法调节PPARγ相关通路干预动脉粥样硬化的作用机制。方法:选取25只C57BL/6小鼠作为空白组,68只ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组(24只)、中药组(22只)、对照组(22只),12周后观察小鼠状态,主动脉HE染色、油红O染色观察血管病理变化、斑块面积,并通过免疫组化、Western blot观察血管ox-LDL、PPARγ、CD36、ABCA1蛋白表达情况。结果:(1)一般情况:空白组小鼠状态良好,皮色光亮,活跃,饮食饮水正常;模型组大鼠状态较差,皮毛油腻、晦暗,神情萎靡,饮食稍差,饮水正常;与模型组相比较,中药组及对照组给药后均有不同程度改善。(2)HE染色及油红O病理图片显示:空白组主动脉未见AS斑块;与空白组相比,模型组AS斑块面积显著增大;与模型组相比,对照组、中药组AS斑块面积明显减小。(3)免疫组化法及Western blot检测小鼠主动脉ox-LDL、PPARγ、CD36、ABCA1蛋白表达:与空白组比较,模型组小鼠主动脉PPARγ、ABCA1蛋白表达显著降低,ox-LDL、CD36蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,中药组小鼠主动脉PPARγ、ABCA1蛋白表达明显升高(P<0.05),CD36明显降低(P<0.01),ox-LDL降低,但无统计学意义(P>0.05)。结论:消癥通络法能够抑制PPARγ介导的CD36信号通路,促进ABCA1信号通路,从而达到改善血管内皮炎症反应,抑制巨噬细胞泡沫化,延缓AS进展的目的。

Src介导ERK信号通路对宫颈癌细胞增殖凋亡的作用

目的 探讨Src介导ERK信号通路对宫颈癌细胞增殖凋亡的作用。方法 采用体外细胞实验方法，以宫颈癌细胞Hela（HPV阳性）和C33A（HPV阴性）为研究对象，施加Src激酶选择性抑制剂（PP2）对Src激酶进行抑制。于抑制前后采用流式细胞术（FCM）检测各组细胞的周期及凋亡情况，分别采用Real-time PCR法和Western-blot法检测各组细胞ERK 1/2、c-Fos和c-Jun的mRNA和蛋白表达水平。应用SPSS 20.0软件进行数据录入和分析。结果 Src抑制后，Hela和C33A细胞均显示增殖指数降低，凋亡率升高，处于G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例降低，ERK 1、ERK 2、c-Fos和c-Jun的mRNA含量升高，ERK 1/2、磷酸化ERK 1/2（p-ERK 1/2）和磷酸化c-Fos（p-c-Fos）蛋白表达水平降低，c-Jun和磷酸化c-Jun（p-c-Jun）蛋白表达水平升高。Hela细胞凋亡率、p-ERK 1/2和c-Fos蛋白在Src抑制前后的变化低于C33A细胞。结论 Src活化可以上调ERK信号通路中关键因子ERK 1/2和c-Fos磷酸化蛋白的表达，促进宫颈癌细胞的生长与增殖，在宫颈癌变中发挥重要作用。HPV感染可能对Src介导的ERK信号通路调节具有调节作用。

直肠癌根治术后结肠造口感染患者肠道微环境及CD36/mTORC1信号通路表达

目的 探究直肠癌根治术后结肠造口感染与患者肠道微环境及外周血分化抗原36(CD36)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)通路蛋白表达的关系.方法 选取2016年6月-2021年6月武汉理工大学医院收治的284例直肠癌根治术后结肠造口患者为研究对象,根据术后是否并发造口感染分为感染组(n=82)、对照组(n=202),采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测患者肠道菌群及CD36/mTORC1 mRNA表达.采用多因素Logistic回归分析直肠癌根治术后造口感染的影响因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线探究CD36/mTORC1 mRNA表达对术后造口感染预测价值.结果 感染组大肠埃希菌、肠球菌数量高于对照组(P<0.05),双歧杆菌、乳酸杆菌数量低于对照组(P<0.05);两组菌群失调分度差异有统计学意义(P<0.05),且感染组Ⅲ度失调比例高于对照组(P<0.05);感染组CD36 mRNA、mTORC1 mRNA水平均高于对照组(P<0.05);菌群失调Ⅲ度、CD36 mRNA、mTORC1 mRNA是直肠癌根治术后结肠造口感染的影响因素(P<0.05);CD36 mRNA、mTORC1 mRNA预测术后造口感染的ROC曲线下面积分别为0.887、0.958.结论 直肠癌根治术后结肠造口患者存在肠道菌群失衡,且可能通过激活外周血CD36/mTORC1信号通路增加患者造口感染风险.

基于Nrf2调节CD36的表达研究益气补肾调脂方对非酒精性脂肪性肝炎的保护作用

目的:探讨益气补肾调脂方对非酒精性脂肪性肝炎的保护作用及其作用机制。方法:体外培养L02肝细胞,H;O;构建氧化应激模型,设立对照组、模型组、药物组和抑制剂组。CCK8检测各组细胞的存活率,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡水平、细胞内活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位,ELISA法检测各组细胞内丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量,Western Blot检测各组细胞内Nrf2信号通路相关蛋白的表达水平。结果:益气补肾调脂方药液处理细胞,可显著提高氧化应激模型中细胞的存活率(P<0.01),降低凋亡、ROS水平、线粒体膜电位及MDA、LDH、ALT、AST含量(P<0.05,P<0.01),增加GSH含量及Nrf2蛋白的表达水平(P<0.01)。结论:益气补肾调脂方通过活化Nrf2信号通路,调节CD36的表达,改善非酒精性脂肪性肝炎。

HCV感染通过Erk信号的激活上调PTTG1的表达

为探讨丙型肝炎病毒(HCV)感染导致肝细胞癌发生的分子机制,利用前期研究建立的体外HCV细胞培养体系,将HCVJFH-1RNA转染CD81-Huh7细胞,确定能够获得感染性HCV后,收集HCV转染后10,50,100和150d的细胞,采用RealtimePCR及WesternBlot法检测不同时间点细胞内垂体瘤转化基因1(PTTG1)基因和蛋白水平的表达情况,同时检测总MAPK/Erk1/2,磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)蛋白的表达。随后,用干扰素抑制HCV的感染,再检测PTTG1及MAPK/Erk1/2的表达情况,以及用MAPK/Erk抑制剂(PD98059)阻断MAPK/Erk1/2的磷酸化后,检测PTTG1的表达情况。结果显示,HCV转染的细胞与未转染细胞比较,PTTG1的mRNA和蛋白表达均显著增加,p-Erk1/2蛋白显著升高(P<0.05);抑制HCV感染显著降低PTTG1的表达和MAPK/Erk1/2的磷酸化(P<0.05);MAPK/Erk1/2抑制剂显著降低了PTTG1基因和蛋白的表达(P<0.05)。体外HCV感染可以导致MAPK/Erk信号通路的磷酸化,进一步导致原癌基因PTTG1的表达增加,这可能是慢性HCV感染导致HCV相关性肝细胞癌发生的分子机制之一。

牙髓炎的发病机制和分子靶标研究

目的鉴定牙髓炎的发病机制和分子靶标。方法通过GEO数据GSE77459 (2016年2月)和GSE92681(2017年12月)确定牙髓炎组织中的差异表达基因。富集分析和基因集富集分析深入评价差异基因在牙髓炎过程中的作用机制。通过PPI网络和分子实验鉴定出牙髓炎相关的关键因子。结果在GSE77459数据的牙髓炎组织中发现了1280个差异表达基因(DEGs)。经过GSE92681数据集验证到81个DEGs。富集分析和基因集富集分析发现DEGs与免疫及炎症反应显著相关。PPI网络分析筛选了55个网络基因,并识别出CD44为核心网络因子和调控基因。通过实时定量聚合酶链反应和Western blot验证了CD44在牙髓炎组织中显著表达上调。结论 CD44是牙髓炎的潜在生物标志物及治疗靶标,并通过ERK1/2信号通路参与到牙髓炎的发展过程中。

肾病综合征氧化低密度脂蛋白脂质肾损伤的实验研究

目的 通过观察氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）对系膜细胞（Mesangial Cells,MCs）分泌炎症介质功能的影响及MAPK信号通路和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）活性的改变,进一步阐明脂质在肾损伤中的作用机制.方法 利用ox-LDL诱导大鼠系膜细胞增殖,分别采用ELISA、real-time PCR、western blot技术检测MCs炎症介质、MAPK通路相关蛋白（p38、JNK、ERK）及NF-κB的表达水平.结果 利用ox-LDL诱导大鼠系膜细胞增殖并加入CXCR6受体后,其表面炎症因子[CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17、干扰素（IFN）、白细胞介素（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）]的表达水平以及MAPK信号通路（p38、JNK、ERK）、NF-κB的磷酸化水平显著升高（P〈0.01）.结论 ox-LDL可促使系膜细胞释放CXCL16、CD36、ADAM10、ADAM17、IFN、IL6、TNF-α等炎症介质,CXCR6可介导这一途径.ox-LDL激活MAPK信号转导通路,使p38、ERK1/2、SAPK/JNK的磷酸化水平升高,激活了NF-κB p65的活性,CXCR6-CXCL16介导MAPK信号途径.

CD36在炎症反应和脂质代谢中的作用

白细胞分化抗原36(cluster of differentiation 36,CD36)是一种高度糖基化的单链跨膜蛋白,属B型清道夫受体。其功能较为广泛,不仅可以识别“异己”成分,诱发免疫应答,还参与多种生理、病理过程。CD36作为膜受体与其他膜蛋白和胞质蛋白组成不同的信号通路。CD36是TRL4的辅助受体,可识别病原体相关分子模式,级联NF-κB信号通路,在天然免疫过程发挥作用;作为修饰脂蛋白受体,级联MAPK通路,诱发无菌性炎症及脂代谢紊乱,并参与动脉粥样硬化病变;作为外源长链脂肪酸受体,通过AMPK/mTOR信号通路在能量代谢及脂质蓄积过程中发挥调控作用。该文综述了CD36的分子特征及其偶联相关信号通路在天然免疫和脂代谢等方面的作用与机制,展示CD36的多功能特点,为相关生物医学研究提供依据。

CD36在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用

非酒精性脂肪性肝病的发病率快速上升且趋于年轻化,已经成为危害人类公共卫生健康的重大问题,其相关分子机制和分子靶点成为研究热点。CD36属于清道夫受体,参与脂肪酸的跨膜转运过程,对肝脏的代谢至关重要。其中,CD36可介导代谢失调的炎症反应进而促进肝脏疾病的发生发展。该文综述CD36的功能与其在肝脏代谢性疾病进展中的作用及其相关机制。

咖啡酸苯乙酯衍生物PEC01抗小鼠G422神经胶质瘤药效学作用及其机制

本研究旨在初步探索PEC01抑制小鼠G422神经胶质瘤的活性及其作用机制。采用MTT法、流式细胞术(FCM)、细胞划痕实验和Transwell细胞穿膜实验分别检测PEC01对G422细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。采用皮下移植的小鼠G422胶质瘤模型评价PEC01的体内药效学。动物福利和实验过程均遵循中国医学科学院北京协和医学院药物研究所动物伦理委员会的规定。Western blot检测PEC01作用2、96 h的G422细胞及30.0 mg·kg^(-1)PEC01给药后的小鼠G422肿瘤组织中EGFR、Src及下游MAPK/ERK、PI3K/Akt/mTOR通路蛋白水平。结果显示,PEC01以时间和剂量依赖性方式明显抑制体外G422细胞增殖, 96 h作用时的IC;为(9.02±0.36)μmol·L^(-1);PEC01(10.0和20.0μmol·L^(-1))作用96 h后,可明显诱导G422细胞发生早期和晚期凋亡;PEC01 [(0.625~5.0)μmol·L^(-1)]在12~48 h剂量依赖地显著抑制G422细胞划痕愈合能力;与DMSO组相比,不同浓度PEC01 (5.0、10.0和20.0μmol·L^(-1))作用8 h后Transwell穿膜的G422细胞数量明显减少。体内药效学实验中, PEC01 (30.0和60.0 mg·kg^(-1))作用14天后的瘤重抑制率分别为72.29%和59.44%。Western blot结果显示,与DMSO组相比, PEC01在2和96 h作用时, G422细胞中p-EGFR、p-Src蛋白表达明显降低;PEC01作用96 h后G422细胞中MAPK/ERK、PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白以及c-myc和HIF-1α表达下调;侵袭转移相关蛋白Snail、N-cadherin和MMP-9表达明显降低;cyclin E1、cyclin B1/CDK1蛋白水平明显下调。研究结果表明,咖啡酸苯乙酯衍生物PEC01具有较好的体内外抗小鼠G422胶质瘤活性,其抗肿瘤作用可能是通过抑制EGFR、Src激酶活性和表达水平,调控下游MAPK/ERK、PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而通过抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡、抑制侵袭转移等作用实现的。