炎症应激加重CD36基因敲除小鼠胰岛素抵抗

目的研究炎症能否加重CD36基因敲除小鼠胰岛素抵抗。方法14周正常饮食喂养的野生型C57BL/6(n=7)和CD36基因敲除(CD36KO)小鼠(n=12),并将CD36KO小鼠按随机数字表法分为炎症刺激组和无炎症刺激组,分别进行糖耐量、胰岛素测定和甘油三酯(TG)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及肝脏组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6激酶(S6K)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、pIRS-1,2的基因和蛋白表达相关检测。结果与野生型小鼠相比,CD36KO无炎症刺激组存在胰岛素抵抗,胰岛素抵抗指数增加[(3.01±1.24)vs(0.81±0.12),P<0.05],TG增高[(0.83±0.15)mmol/Lvs(0.21±0.06)mmol/L,P<0.05],肝脏mTOR、S6K基因及蛋白水平增高,IRS-1基因及蛋白水平降低,pIRS-1,2蛋白水平增加。与CD36KO无炎症刺激组相比,炎症刺激组小鼠胰岛素抵抗加强,胰岛素抵抗指数增加[(4.65±1.54)vs(3.01±1.24),P<0.05],TG[(2.66±0.17)mmol/Lvs(0.83±0.15)mmol/L,P<0.05],SAA、IL-6、TNF-α水平增高[(13.62±5.05)ng/mlvs(5.74±1.54)ng/ml,P<0.05;(43.81±1.23)pg/mlvs(35.24±4.13)pg/ml,P<0.05;(235.1±32.6)pg/mlvs(169.2±36.1)pg/ml,P<0.05],肝脏的mTOR和S6K基因及蛋白水平增高,IRS-1基因及蛋白水平降低,pIRS-1,2蛋白水平增加。结论炎症应激可以加重CD36基因敲除小鼠胰岛素抵抗。

炎症对SRA/CD36双基因敲除小鼠肝LDL受体表达的影响

目的探讨炎症对清道夫受体A（scavenger receptor A，SRA）和CD36双基因敲除（SRA-／-/CD36-/-）小鼠肝脏LDL受体表达的影响及其潜存机制。方法将1～3月龄，体质量为18～23g的SRA-/-／CD36-/-雄性小鼠随机分为对照组（n=7），炎症组（n=6），2组均喂以高脂饮食，炎症组小鼠采取皮下注射酪蛋白方法诱导产生慢性炎症模型，14周后应用实时荧光定量RT—PCR技术和免疫组化方法检测肝脏LDL受体基因及调控其转录的SREBP2、SCAP基因表达水平，并观察肝脏形态学及血生化指标的变化。结果与正常对照相比，炎症状态时肝脏LDL受体、SREBP2、SCAP mRNA水平显著高于对照组（P〈0．05），蛋白表达的水平也较对照组明显升高；肝细胞内脂质沉积加重，炎性细胞浸润；血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平均明显降低（P〈0．05），高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯降低不明显。结论炎症通过促进肝细胞内SREBP2、SCAP的表达，进而增强细胞膜表面LDL受体的表达，最终导致肝细胞内胆固醇沉积。

中药虎杖和山楂提取物对载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞PPARγ、ABCA1及CD36 mRNA表达的影响

目的观察中药虎杖、山楂配伍对载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内过氧化体增殖物激活型受体γ、三磷酸腺苷结合盒转运子A1及CD36 mRNA表达的影响,从基因水平探讨虎杖和山楂配伍对动脉粥样硬化泡沫细胞形成的干预机制。方法培养载脂蛋白E基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞,分为空白组、虎杖苷组、山楂提取物组、虎杖苷+山楂提取物组、洛伐他汀组、罗格列酮组及模型组。除空白组外,其他各组均同时加入氧化型低密度脂蛋白及脂多糖。各组细胞在培养箱内共孵育(泡沫化)2天,以逆转录聚合酶链反应法检测0 h、24 h和48 h各组细胞内过氧化体增殖物激活型受体γ、三磷酸腺苷结合盒转运子A1及CD36的mRNA表达。结果与空白组比较,干预24 h和48 h后,模型组及各用药组三个指标的表达均显著增高(P<0.01);与模型组比较,干预24 h后,虎杖苷+山楂提取物组和罗格列酮组过氧化体增殖物激活型受体γmRNA表达显著增高,虎杖苷组、虎杖苷+山楂提取物组和罗格列酮组三磷酸腺苷结合盒转运子A1 mRNA表达显著增高(P<0.05或P<0.01),各用药组CD36 mRNA表达无显著差异(P>0.05);干预48 h后,各用药组过氧化体增殖物激活型受体γ和三磷酸腺苷结合盒转运子A1 mRNA表达均显著增高,CD36 mRNA表达显著降低,且虎杖苷+山楂提取物组优于虎杖苷组、山楂提取物组及洛伐他汀组(P<0.05或P<0.01)。结论虎杖和山楂配伍可能具有与罗格列酮相似的过氧化体增殖物激活型受体γ激动作用,通过上调载脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬细胞过氧化体增殖物激活型受体γ和三磷酸腺苷结合盒转运子A1 mRNA表达、下调CD36 mRNA表达的调控途径显著抑制巨噬细胞泡沫化过程,阻止动脉粥样硬化进程。

肝脏特异性CD36基因敲除小鼠的制备及鉴定

目的：运用Cre/Loxp重组酶系统构建肝脏特异性CD36基因敲除小鼠并进行鉴定和验证,为研究CD36的生物学功能奠定基础。方法：构建CD36打靶载体,电转转染胚胎干细胞,通过长链PCR筛选出正确同源重组的阳性克隆,阳性胚胎干细胞克隆经扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合小鼠,再与Flp小鼠交配筛选获得Flox杂合子小鼠,该小鼠与引进的Alb-Cre小鼠交配,在F3代获得CD36fl/fl：Alb-Cre＋基因型小鼠,即为肝脏特异性CD36敲除小鼠。采用PCR鉴定小鼠基因型,PCR、实时荧光定量PCR和Western blot验证小鼠肝脏CD36敲除效果,Western blot检测小鼠肾脏、脂肪和心肌组织CD36表达情况,HE染色观察小鼠肝脏形态学改变。结果：建立了CD36基因的Flox杂合子小鼠,与Alb-Cre小鼠交配后,在F3代筛选出CD36fl/fl：AlbCre-和CD36fl/fl：Alb-Cre＋基因型小鼠,DNA水平证实CD36fl/fl：Alb-Cre＋基因型小鼠肝脏CD36基因通过Cre/Loxp重组酶系统被敲除。与CD36fl/fl：Alb-Cre-基因型小鼠相比,CD36fl/fl：Alb-Cre＋基因型小鼠肝脏CD36mRNA和蛋白表达水平显著降低,肾脏、脂肪和心肌组织CD36蛋白表达无差别,肝脏形态学特征无明显差异。结论：通过Cre/Loxp重组酶系统成功构建了肝脏特异性CD36基因敲除小鼠,为研究CD36在肝脏代谢和肝脏疾病中的功能提供了动物模型。

南蛇藤素对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化斑块内CD40配体表达、巨噬细胞和平滑肌细胞数量的影响

目的:探讨南蛇藤素对高脂饲养ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)主动脉粥样硬化斑块内CD40配体表达、巨噬细胞和平滑肌细胞数量的影响。方法:8周龄雄性ApoE-/-小鼠12只,随机分为南蛇藤素组或二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组,每组各6只。均给以高脂饲养8周,在高脂饲养的后4周,分别给予南蛇藤素2mg·kg-1.d-1或相当剂量的DMSO腹腔注射(ip)4周。麻醉处死小鼠后,取小鼠主动脉,以石蜡包埋,行主动脉根部连续切片.。免疫组化法检测主动脉粥样硬化斑块内CD40配体、CD68和平滑肌α-actin表达水平,以Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析。结果:与对照组相比,南蛇藤素组主动脉粥样硬化斑块内CD40配体表达显著减少(P<0.05);巨噬细胞的阳性率显著降低(P<0.05);而两组间动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞的阳性率没有显著差异(P>0.05)。结论:南蛇藤素可能通过减少ApoE-/-小鼠粥样斑块内CD40配体的表达和巨噬细胞的聚集,抑制动脉粥样硬化斑块中炎症反应,而发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

肝X受体激动剂对ApoE基因敲除小鼠主动脉壁C-反应蛋白和CD40配体表达及平滑肌细胞含量的影响

目的探讨肝X受体(liver X receptor,LXR)激动剂T0901317对高脂饲养ApoE基因敲除(apolipoprotein E gene knockout,ApoE-/-)小鼠在动脉粥样硬化病变形成的早期动脉壁内C-反应蛋白(CRP)和CD40配体(CD40L)表达及平滑肌细胞含量的影响。方法8周龄雄性ApoE-/-小鼠12只,按随机数字表法分入LXR激动剂T0901317组和二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组,每组6只。均给予高脂饲养8周,在高脂饲养的后4周,分别给予LXR激动剂T090131720mg·kg-1·d-1或相当剂量的DMSO腹腔注射。麻醉处死小鼠后,取小鼠主动脉,以石蜡包埋,行主动脉根部连续切片,采用免疫组化法检测主动脉壁内CRP、CD40L和平滑肌细胞α-actin的表达,以Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析。结果LXR激动剂组动脉壁CRP表达水平较对照组明显减少(P<0.05),LXR激动剂组动脉壁CD40L表达水平较对照组明显减少(P<0.05),动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞α-actin表达水平与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。结论LXR激动剂可能通过抑制ApoE-/-小鼠动脉壁中CRP和CD40L的表达,减轻血管壁的炎症反应,从而发挥抗动脉粥样硬化形成的作用。

膜糖蛋白CD36缺失对小鼠胰岛素抵抗的影响

目的:研究膜糖蛋白CD36缺失对C57BL/6小鼠胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)的影响。方法:14周高脂饮食喂养的野生型C57BL/6小鼠和CD36基因敲除(CD36KO)小鼠,每组7只,分别进行糖耐量,胰岛素耐量和胰岛素释放试验,以及血清中甘油三酯(Triglyceride,TG)和游离脂肪酸(Free fat acid,FFA)的测定。结果:与野生型C57BL/6相比,CD36KO小鼠血糖水平增高,糖耐量实验异常,胰岛素释放曲线延迟,血清中TG((80±28.74)vs(36±18.88)mg/dl,P<0.05)和FFA((13.61±1.08)vs(0.8±0.06)mmol/L,P<0.05)水平增加。结论:CD36缺失可以促进小鼠IR。

CD52单抗通过清除活化T细胞对IL-10基因敲除小鼠结肠炎的干预作用

目的:观察CD52单抗对IL-10基因敲除小鼠结肠炎的干预作用并探究其干预作用的可能机制。方法:给予CD52单抗治疗后,计算疾病活动度指数,检测结肠病理学评分,外周血、脾脏及结肠固有层单个核细胞中T淋巴细胞的清除情况,结肠组织炎性因子水平及相关细胞因子的m RNA转录水平的变化。结果:CD52单抗能有效降低疾病活动度评分、结肠病理学评分,能显著地清除模型小鼠外周血、脾脏及结肠固有层单个核细胞中CD3+T细胞,明显降低结肠组织中IFN-γ、IL-17的表达水平,同时增加了IL-5和IL-13的表达,并相应下调TNF-α、IFN-γ、IL-17和IL-6及炎症调控因子IL-12和IL-23的m RNA表达水平。结论:抗CD52单抗能有效地治疗IL-10基因敲除小鼠的结肠炎,其干预效果与活化T细胞的直接清除相关,此外,其对IL-12/23通路的下调及Th2反应的诱导作用亦可能与干预作用相关。

炎症促进清道夫受体基因敲除小鼠主动脉脂质积聚的分子机制

目的探讨炎症促进清道夫受体A和CD36双敲(SR double knockout,SRDKO)C57BL/6J小鼠主动脉固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein2,SREBP2)表达,加重主动脉脂质异常积聚的分子机制。方法 13只SRDKO雄性小鼠,按体质量大小,采用完全随机的方法,分为炎症组(n=6)和对照组(n=7)。喂养高脂饮食14周,检测血清炎症因子和脂质水平;油红O染色观察主动脉脂质积聚;实时定量PCR和免疫组织化学染色,分析主动脉低密度脂蛋白受体(LDLr)、调控其转录的SREBP2及SREBP2裂解激活蛋白(SCAP)mRNA和蛋白表达水平。结果炎症组血清淀粉样蛋白A(SAA)水平比对照组明显增高[(10.32±2.88)ng/mlvs(5.50±2.67)ng/ml,P<0.05];主动脉切片油红O染色结果发现,炎症组比对照组脂质积聚明显增加;炎症组主动脉的SREBP2、SCAP和LDLrmRNA和蛋白表达水平比对照组明显增高(P<0.05)。结论 SRDKO小鼠在炎症状态下,促进主动脉胆固醇敏感器SCAP和SREBP2表达,上调LDLr,使胞内摄入胆固醇增加,加重主动脉脂质的异常积聚。

双重荧光实时PCR法鉴定SRBⅠ基因敲除小鼠

目的建立一种双重荧光实时PCR鉴定B族Ⅰ型清道夫受体(SRBⅠ)基因敲除小鼠的方法。方法提取小鼠尾尖DNA,应用自行设计的鉴定野生型和敲除型SRBⅠ基因的引物和探针,经PCR扩增后,在FAM通道及CY5通道判断小鼠基因型。同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果仅在FAM通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因野生型小鼠,仅在CY5通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因敲除型小鼠,在两个通道都出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因杂合型小鼠。结果与DNA测序法吻合,检测野生型和突变型的灵敏度均达4×101拷贝/μL。结论新方法简单、快速、准确,适用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。

小鼠抗小鼠CD226单克隆抗体的制备及应用

目的利用CD226基因敲除小鼠作为免疫动物,制备抗小鼠CD226单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法用真核表达的重组小鼠CD226蛋白免疫动物,利用常规B细胞杂交瘤技术制备抗小鼠CD226 mAb,进行流式细胞术、Western blot实验等应用的鉴定。建立夹心ELISA检测小鼠可溶性CD226的方法。应用已建立的夹心ELISA检测脂多糖诱导脓毒症小鼠血浆可溶性CD226浓度。结果获得2株分泌小鼠抗小鼠CD226 mAb的杂交瘤细胞株,克隆号分别命名为mA1.1和mA1.3,抗体亚类均为IgG1,轻链型均为κ。鉴定发现所获得的mAb可以应用于流式细胞术,能够识别细胞表面外源性转染表达的CD226和小鼠血小板表面的CD226;可以应用于Western blot实验,结合相对分子量(Mr)为67000的淋巴细胞膜蛋白,与CD226的Mr相符。用mA1.3 mAb包被酶标板,mA1.1 mAb标记辣根过氧化物酶或生物素,敏感度分别为3.0 ng/mL和0.25ng/mL,检测脓毒症小鼠血浆中可溶性的CD226浓度较正常小鼠降低。结论成功制备了识别小鼠CD226的小鼠mAb,可应用多种检测技术。

炎症干扰胆固醇调节元件结合蛋白2致ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠肝脏脂质的异常积聚

目的 研究炎症是否通过干扰核转录因子胆固醇调节元件结合蛋白2（SREBP-2）而致ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠肝脏胆固醇的异常积聚.方法 将8周龄ApoE/SRA/CD36三基因敲除雄性小鼠随机分为对照组（n=8）和炎症组（n=8）,2组均喂以西方饮食（Western diet）,炎症组小鼠皮下注射10%酪蛋白建立慢性炎症模型,对照组注射相应量磷酸盐缓冲液,14周后处死,测定血清中炎症介质和脂质的水平及肝组织中胆固醇含量,油红O、免疫组织化学染色后观察肝脂质沉积程度以及组织形态变化,实时定量PCR法检测肝脏SREBP裂解激活蛋白（SCAP）、SREBP-2及其下游基因低密度脂蛋白受体（LDLr）mRNA水平.对计量资料采用两样本均数比较的t检验进行统计学分析.结果 炎症状态下,血清中总胆固醇[（7.72±1.70）mmol/L]、低密度脂蛋白胆固醇[（2.94±0.44）mmol/L]、高密度脂蛋白胆固醇[（2.24±0.63）mmol/L]水平均显著降低,与对照组[分别为（13.23±3.61）mmol/L、（9.28±3.66）mmol/L、（4.13±0.42）mmol/L]比较,t值分别为3.383、4.245、5.937,P值均＜0.05;肝组织中胆固醇含量显著增加;油红O染色表明,胆固醇在肝脏中的沉积异常增多（t=2.707,P＜0.05）;实时定量PCR和免疫组织化学检测结果表明胆固醇代谢相关基因SREBP2、LDLr和SCAP的mRNA和蛋白质表达水平显著增加. 结论炎症可以通过干扰SREBP-2导致低密度脂蛋白胆固醇摄取异常,造成肝脏脂质沉积增多和损害.

CD248+CAFs激活Hippo通路介导细胞外基质重塑促进NSCLC转移的机制研究

目的癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)介导细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重塑在促进肿瘤转移中起重要作用。拟探讨CD248作为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)来源的CAFs潜在标志物通过介导ECM重塑促进NSCLC转移的相关机制。方法分析NSCLC基质中CD248和I型胶原蛋白表达的相关性。利用原子力显微镜检测ECM硬度;将CD248差异表达的CAFs与NSCLC细胞系进行共培养,利用Transwell检测NSCLC细胞的迁移和侵袭。利用RNA-seq和ATAC-seq技术寻找CD248+CAFs在ECM重塑中的相关分子机制;利用成纤维细胞特异性CD248基因敲除小鼠建立肿瘤肺转移模型,评估CD248在促进NSCLC转移中的作用。结果CAFs表达CD248可诱导I型胶原形成,增加ECM硬度,促进NSCLC的侵袭和迁移。CD248+CAFs激活Hippo通路可诱导CTGF表达,从而促进ECM中I型胶原的重塑。动物实验证实与野生型小鼠相比,CD248基因敲除小鼠发生肿瘤肺转移的能力显著降低。结论CD248+CAFs能够激活Hippo通路诱导CTGF的表达,促进ECM中I型胶原的重塑增加ECM的硬度,促进NSCLC的转移。

抗血小板药物与阻断CD40信号对动脉粥样硬化的影响

目的:探讨抗血小板药物、抗CD40L(CD40配体)抗体及合用对动脉粥样硬化的影响。方法:雄性载脂蛋白E基因敲除小鼠随机分为模型对照组(n=10)、抗血小板药物组(n=10,阿司匹林+氯吡格雷)、抗CD40L抗体组(n=8,抗CD40L抗体)、合用组(n=9,阿司匹林+氯吡格雷+抗CD40L抗体)。并取与载脂蛋白E基因敲除小鼠有相同遗传背景的健康雄性近交系C57BL/6小鼠6只作为正常对照组。测血脂、可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)和可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)浓度。观察主动脉组织病理形态学改变,免疫组织化学法测定斑块部位巨噬细胞、平滑肌细胞百分率。Western杂交分析测定基质金属蛋白酶-9的蛋白表达。结果:抗血小板药物及抗CD40L抗体治疗可明显降低sVCAM-1和sICAM-1浓度(P<0.01),减轻动脉粥样硬化病变,减少斑块部位巨噬细胞,增加平滑肌细胞数量(P<0.01),对血脂无影响(P>0.05),合用则作用增强(P<0.05)。抗CD40L抗体可降低基质金属蛋白酶-9的表达(P<0.01),抗血小板治疗无此作用。结论:抗血小板治疗及阻断CD40信号可抑制炎症反应,减轻动脉粥样硬化病变,稳定斑块,对血脂无影响,联合治疗有协同作用。

阻断CD40-CD40配体系统对动脉粥样硬化的影响

目的探讨阻断CD40-CD40配体系统对动脉粥样硬化的影响。方法18只载脂蛋白E基因敲除小鼠随机分为阳性对照组(n=10)和抗CD40配体抗体组(n=8),并以近交系C57BL/6小鼠作为正常对照。测定血脂、可溶性血管细胞粘附分子1和可溶性细胞间粘附分子1浓度。观察主动脉组织病理形态学改变,免疫组织化学法测定斑块部位巨噬细胞、平滑肌细胞和CD4+T细胞百分率。Western杂交分析测定基质金属蛋白酶9的蛋白表达。结果抗CD40配体抗体治疗可明显降低可溶性血管细胞粘附分子1和可溶性细胞间粘附分子1浓度(P<0.01),对血脂无明显影响(P>0.05);可减轻动脉粥样硬化病变,减少斑块部位巨噬细胞和CD4+T细胞,增加平滑肌细胞数量(P<0.05),降低基质金属蛋白酶9的表达(P<0.01)。结论阻断CD40-CD40配体系统可使血清可溶性粘附分子浓度下降,抑制炎症反应,从而减轻动脉粥样硬化病变,对血脂无影响。

Notch/Rbpj对CD133^(+)室管膜细胞增殖和分化的影响

位于侧脑室(LV)的室管膜下区(SVZ)是成体神经干细胞(NSCs)的最大发生区,室管膜细胞紧邻SVZ具有NSCs属性。Rbpj是Notch信号通路中的关键靶点,但Notch信号通路如何影响成体CD133^(+)室管膜细胞的增殖和分化目前并不清楚。通过原代培养的胚胎室管膜细胞和2~3月龄成体Rbpj基因敲除小鼠,分析在干扰或敲除掉CD133^(+)室管膜细胞中的Rbpj基因后其增殖和分化发生的变化。结果发现,无论是细胞还是动物水平,当干扰或敲除掉Rbpj基因后,幼期/早期神经前体细胞和成熟神经元的数目均明显增加,该时段细胞也出现明显增殖。

白细胞介素-6调节CD4^＋T细胞的死亡机制

最近日本科学家发现，增强白细胞介素-6（IL-6）表达可抑制超抗原介导激活的CD4^＋T细胞死亡。超抗原诱导的CD4^＋T细胞死亡在IL-6基因敲除小鼠增加，而在增强IL-6-gp130-STAT3信号途径的小鼠则降低。血清γ-干扰素（IFN-γ）浓度与IL-6信号强度成反比，IFN-γ缺乏可抑制超抗原诱导激活CD4^＋T细胞死亡，这些提示IL-6可能通过影响IFN-7表达抑制CD4^＋T细胞死亡。

CD52单克隆抗体通过抑制Th1/17介导的炎症及诱导调节性T细胞反应对克罗恩病模型小鼠结肠炎的治疗作用

拟观察CD52单克隆抗体对IL-10基因敲除克罗恩病模型小鼠结肠炎的治疗作用并揭示其可能的机制。结果显示,CD52单克隆抗体能有效治疗模型小鼠结肠炎症,降低Th1/17相关炎性因子的表达,同时能增加结肠固有层调节性T细胞的比例及功能。提示其治疗作用的机制可能与抑制Th1/17介导的炎症及诱导调节性T细胞反应相关。