CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞原代细胞 白血病体外净化效应

本研究旨在探讨免疫细胞性一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞白血病(CML)原代白血病 细胞的体外净化效应。培养并扩增PA317/iNOS细胞并用G418筛选;用NIH3T3细胞测定病毒滴度,分离外周血 单个核细胞并用抗CD3单克隆抗体激活;病毒感染靶细胞CD3AK及用G418筛选,用逆转录-聚合酶链反应 (RT PCR)检测CD3AK/iNOS中iNOScDNA的转录;用硝酸还原酶法检测CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含 量以及iNOS活性;用系列稀释半定量巢式RT PCR检测CML患者白血病原代细胞经CD3AK/iNOS细胞净化后 bcr/abl融合基因的表达水平。结果表明,PA317/iNOS细胞能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒;NIH3T3细胞 测定病毒滴度为1.0×105CFU/ml;RT PCR检测发现CD3AK/iNOS细胞中有iNOScDNA的转录;CD3AK/iNOS 细胞培养上清中NO含量和iNOS活性较CD3AK细胞明显升高。上述两项指标,经统计学检验,均有显著性差异 (P<0.001,P<0.001)。系列稀释半定量RT PCR检测发现,经CD3AK/iNOS细胞净化后CML患者白血病细胞 bcr/abl融合基因的表达明显下调。实验结果统计分析表明,CD3AK/Neo细胞组净化后与CD3AK/iNOS细胞组净 化后bcr/ablmRNA表达的比较具有显著性差异(P<0.001)。结论:逆转录病毒可介导iNOS基因转入CD3AK细 胞,成功地构建了CD3AK/iNOS;CD3AK/iNOS能明显地增加NO含量和iNOS活性,应用CD3AK/iNOS可能成 为一个有效的AHSCT体外净化方法。

CD3AK/iNOS细胞对白血病细胞体外杀伤的研究

背景与目的:LAK细胞已用于临床移植物净化。CD3AK细胞是CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞。本研究旨在经逆转录病毒介导iNOS基因转染人免疫活性细胞CD3AK建立CD3AK/iNOS细胞,并探讨其对白血病细胞株K562及其耐药株K562/ADM的杀伤作用。方法:培养PA317/pLNC-iNOS细胞获得病毒上清;CD3McAb联合小剂量的IL-2激活分离的外周血单个核细胞;含逆转录病毒颗粒的细胞培养上清感染靶细胞CD3AK细胞。测定CD3AK/iNOS、CD3AK细胞培养上清NO含量以及iNOS活性。MTT法观察CD3AK/iNOS、CD3AK对K562和K562/ADM细胞杀伤活性。结果:(1)CD3AK/iNOS、CD3AK中NO含量分别为(378.60±41.57)μmol/L,(98.07±22.31)μmol/L(P<0.001);CD3AK/iNOS、CD3AK中iNOS活性分别为(20.77±2.49)U/ml,(9.81±1.96)U/ml(P<0.001)。(2)MTT法观察CD3AK/iNOS对K562和K562/ADM杀伤活性分别为(64.85±18.13)%,(63.80±9.93)%。CD3AK杀伤活性分别为(45.66±17.46)%,(47.85±12.01)%。CD3AK/iNOS与CD3AK相比差异有显著性(P<0.05)。结论:CD3AK/iNOS分泌的NO含量、iNOS活性较CD3AK明显提高,且对K562及K562/ADM杀伤作用也更强;但CD3AK/iNOS对K562及K562/ADM杀伤作用无显著性差异。

iNOS基因转染人CD3AK细胞的实验研究

目的 构建一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞。方法 用PCR技术从 pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒 pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。用病毒上清感染人CD3AK细胞。测定CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含量及iNOS活性。结果 经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒的正确性。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1× 10 4CFU /ml。经重组逆转录病毒上清转染后CD3AK /iNOS细胞合成并分泌的NO含量及iNOS活性比CD3AK细胞明显增高。结论 逆转录病毒载体 pLNCX可有效地介导iNOS的转染。成功构建CD3AK/iNOS细胞 ,有效提高iNOS活性及NO含量。

CD3AK细胞过继免疫治疗的实验研究

目的: 分析抗CD3分子的单克隆抗体 (mAb)yCD3的免疫学特性和生物学活性, 观察其激活的免疫活性细胞CD3AK体外及动物体内的抑瘤作用。方法: 用流式细胞术(FCM)测定yCD3的特异性, 以及CD3AK细胞的免疫表型和产生细胞因子的情况。用 3H -TdR法测定yCD3对淋巴细胞转化的作用; 乳酸脱氢酶法 (LDH)测定CD3AK细胞的体外细胞毒活性。建立荷瘤小鼠模型, 观察静脉注射CD3AK细胞后肿瘤生长的情况、转移灶数量和小鼠存活天数。结果: yCD3与T细胞呈特异性反应, 5μgyCD3可竞争抑制 70%的标准抗CD3抗体与细胞表面CD3分子的结合。yCD3刺激外周血淋巴细胞增殖的有效浓度为 8μg/L, 并与IL- 2、抗CD28抗体有协同作用。活化的CD3AK细胞中CD3+、CD8+和CD25+细胞增多; 产生IL- 2和IFN γ的CD3+细胞均有不同程度的增加, 在抗CD28抗体协同刺激下分别增加 3. 29和 2. 47倍。当效靶细胞比为 80∶1时, CD3AK细胞对体外肿瘤细胞杀伤的百分率为 57. 54%。分组观察荷瘤动物, CD3AK细胞治疗组的抑瘤率为 33. 17%, 对小鼠肿瘤肺转移的抑制率为39. 70%, 与LAK细胞联合治疗的疗效更显著。结论: yCD3可活化T细胞, 诱导的CD3AK细胞在体外及动物体内显示抑制肿瘤的作用, 在临床抗肿瘤过继性免疫治疗中具有重要意义。

螺旋藻多糖对CD_3AK细胞增殖能力的影响

研究了螺旋藻多糖 ( PS)对 CD3Mc Ab激活的杀伤细胞 ( CD3Mc Ab Activated KillerCells,CD3AK Cells)增殖能力的影响。结果表明 ,当 PS浓度为 2 .5μg· ml-1培养体系条件下 ,对 CD3AK细胞具有明显的刺激细胞增殖作用 ( P<0 .0 2 ) ;对培养长达 2 3d的 CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞 ( K562 细胞 )的活性仍维持在较高的水平 ( 4 6.5%～ 50 % )。提示 PS对辐射损伤和化疗引起的造血功能损伤及在肿瘤的生物治疗领域有较好的应用前景。

CD_3AK细胞介导的MHC非限制性溶瘤作用机制的初步研究

本研究表明体外激活扩增的CD_3AK细胞可以MHC非限制性方式杀伤MHC I类抗原阴性NK敏感的K562细胞和MHC I类抗原阴性NK不敏感的Daudi细胞,杀瘤机制与诱导靶细胞坏死和/或凋亡有关。

淫羊藿甙逆转转化生长因子β_2对LAK、CD_3AK细胞的免疫抑制作用

探讨淫羊藿甙逆转转化生长因子 β2 (TransformingGrowthFactorβ2 ,TGFβ2 )对LAK、CD3AK细胞的免疫抑制作用及其机制。方法 :采用MTT法 ,RT PCR和流式细胞术。结果 :淫羊藿甙能逆转受TGFβ2 抑制的LAK和CD3AK细胞的杀伤活性 ,并能部分恢复受TGFβ2 抑制的LAK细胞表面IL 2Rα表达和CD3AK细胞内穿孔素mRNA水平 ,以及CD3AK细胞的增殖活性。结论 :淫羊藿甙通过恢复LAK细胞IL 2Rα表达 ,提高CD3AK细胞内穿孔素mRNA水平及促进CD3AK增殖 ,逆转TGFβ2 对LAK、CD3AK的免疫抑制作用。

CD_3AK细胞与LAK细胞的比较

抗ＣＤ３单抗和ｒＩＬ－２共刺激法诱生扩增的ＣＤ３ＡＫ与用等量ｒＩＬ－２诱生扩增的ＬＡＫ间有明显差异：１）扩增倍数和细胞毒活性强度及其动态学不同：在诱生初期，ＣＤ３ＡＫ细胞数下降，细胞扩增倍数低于ＬＡＫ（０．８３对１．７，Ｐ＜０．０１）；对Ｋ５６２的细胞毒活性低于ＬＡＫ（３８％对４３．９％，Ｐ＞０．０５），诱生８天后ＣＤ３ＡＫ的扩增倍数和细胞毒活性都上升并超过ＬＡＫ（５．１３对１．４，Ｐ＜０．０１；４９．４％对２６％，Ｐ＜０．０５）。２）细胞表型不同：ＣＤ３ＡＫ中Ｔ细胞较多，ＬＡＫ细胞中ＮＫ表型细胞百分率高。

汉黄芩素提高人CD3AK细胞杀伤肝癌细胞的实验研究和机理探讨

目的：观察汉黄芩素对人CD3AK细胞增殖及对肝癌细胞SMMC-7721杀伤活性的影响,并探讨其发生的机制。方法：分离健康者外周血PBMC;在体外用多种细胞因子联合诱导培养CD3AK细胞。收集培养第7天的CD3AK细胞给予不同浓度汉黄芩素诱导48 h：CCK-8法检测人CD3AK细胞增殖率;MTT法检测汉黄芩素对SMMC-7721细胞生长的影响;流式细胞术（FCM）检测汉黄芩素作用前后CD3AK细胞穿孔素（PFP）、颗粒酶B（Gr B）、CD107a的表达;乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定汉黄芩素对CD3AK细胞杀伤肝癌细胞SMMC-7721活性;Western blot检测药物诱导前后CD3AK细胞胞外信号调节激酶（ERK1/2）蛋白表达。用transwell chambers小室进行药物诱导前后肝癌细胞SMMC-7721迁移率检测。划痕愈合实验观察药物诱导后肝癌细胞SMMC-7721生长融合情况。结果：汉黄芩素能明显促进CD3AK细胞增殖,汉黄芩素浓度为3.2 mg/L时,细胞增殖率比对照组（0 mg/L）高23%,两者比较有统计学差异（P〈0.05）。在汉黄芩素为3.2 mg/L时诱导的CD3AK细胞对靶细胞SMMC-7721杀伤活性最高（60.4%）,与对照组（42.7%）比较差异有统计学意义（P〈0.05）。经汉黄芩素诱导后的CD3AK细胞PFP、Gr B、CD107a表达显著高于对照组（P〈0.05）。汉黄芩素作用48h后的CD3AK细胞其ERK1/2蛋白表达较对照组均有所上调,浓度在12.5~0.8 mg/L时,ERK1/2蛋白表达高于对照组（P〈0.05）。经浓度为50、12.5、3.2、0.8、0.2mg/L汉黄芩诱导48 h后,肝癌细胞SMMC-7721通过transwell小孔细胞数以汉黄芩浓度为12.5 mg/L时最低、肝癌细胞SMMC-7721的融合率以3.2 mg/L时最低,与对照组比较有统计学意义（P〈0.05）。结论：汉黄芩素在一定浓度范围内能够促进CD3AK细胞增殖,增强其对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤活性,抑制SMMC-7721细胞生长、迁移和细胞的融合。汉黄芩素促进CD3AK细胞增殖和功能改变可能与活化细胞ERK1/2蛋白,上调CD3AK细胞表面PFP、Gr B、CD107a的表达有关。

MtbAK细胞与CD3AK、LAK细胞体外增殖和杀瘤活性比较

目的 :比较结核杆菌抗原激活的杀伤细胞 (MtbAK)、CD3AK及LAK细胞的体外增殖能力和杀瘤活性。方法 :分别用结核杆菌抗原 (Mtb Ag)、CD3mAb和rIL 2刺激人外周血单个核细胞 (PBMC) ,在含rIL 2的RPMI 16 40培养液中诱导扩增MtbAk、CD3AK和LAK细胞 ,用计数法动态观察细胞扩增情况 ,在流式细胞仪上分析MtbAK中的γδT细胞比例 ,以MTT法检测三种扩增细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性。结果 :与CD3AK和LAK细胞相比 ,MtbAK细胞具有更强的增殖能力和较高的细胞毒活性。结论 :MtbAK细胞在体外更易于扩增 ,具有较高的杀瘤活性 ,有可能应用于肿瘤患者的临床过继免疫治疗。

B7-H1阻断对CD3AK细胞体外生物学活性的影响

目的:探讨B7-H1阻断对CD3AK细胞增殖活化及其抗肿瘤免疫效应的影响。方法:利用CD3单克隆抗体(mAb)刺激健康人外周血淋巴细胞诱导产生CD3AK细胞,然后利用B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1通路,3H-TdR渗入法检测阻断后CD3AK细胞的增殖能力,ELISA法检测阻断后CD3AK细胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平,同时将CD3AK细胞作用于膀胱肿瘤BIU-87细胞,MTT法检测阻断后CD3AK细胞的杀伤活性。结果:B7-H1阻断后,CD3AK细胞的增殖能力明显增强,体外存活时间明显延长;其分泌IFN-γ、TNF-α的水平明显提高,而分泌IL-10的水平明显下降;同时CD3AK细胞对BIU-87细胞的杀伤活性亦明显升高。结论:阻断B7-H1通路可以促进和维持CD3AK细胞的增殖和活化,并增强其抗肿瘤的免疫效应。阻断B7-H1通路将有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。

脐血CD_3AK细胞的制备、生物活性测定及临床应用初探

目的 研究用脐血单个核细胞制备CD3 AK细胞的抗肿瘤作用 ,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标。方法 分离脐血单个核细胞 ,分别用IL 2和IL 2 +CD3 Ab诱导LAK和CD3AK细胞 ,并测其扩增数量和对K5 6 2细胞的杀伤活性 ;测定肿瘤患者用CD3 AK细胞治疗前后外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性。结果 脐血LAK细胞和脐血CD3 AK细胞均于培养后第 11天时扩增倍数最高 ,分别是培养前的 18倍、2 4倍 ,对K5 6 2的杀伤活性分别是培养前的 2 .6倍和 3.2倍 ;肿瘤患者输注CD3 AK细胞一疗程后 ,其PBMC的NK杀伤活性由 6 2 %升高到 82 % ,平均升高 32 %。结论 (1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3 AK细胞良好的前体细胞。 (2 )LAK和CD3 AK细胞的数量和杀伤能力在培养的第 11天时达高峰 ,而且CD3 AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞。 (3)CD3 AK细胞输注能明显提高肿瘤患者PBMC的NK活性。 (4 )

CD3AK细胞的生物学特性及其抗肿瘤作用

CD3AK细胞是用抗T细胞表而CD3分子的单克隆抗体激活的新型杀伤细胞，在肿瘤的免疫疗法中愈来愈受到重视。本文用抗CD3单克隆抗体(北医太免疫室提供)和rIL-2(日本盐野义制药株式会社产品)共同刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，诱导CD3AK细胞，系统地研究了其生物特性及其体外抗肿瘤活性并与LAK细胞作比较。

人CD3AK细胞杀伤人肺腺癌细胞的形态学观察

抗CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3AK细胞)是一种新型的免疫效应细胞，与LAK细胞相比具有广谱、较高的杀伤活性及低IL-2依赖性的特点，因而受到重视。关于其杀伤机制的研究目前尚无明确报道。本研究把体外培养中贴壁状态的人肺腺癌细胞与用抗CD3单克隆抗体激活的人外周血来源的CD3AK细胞共同培养，电镜下观察了两种细胞的相互作用和靶细胞被杀伤的过程．藉此对CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的机制作一探讨。

α-Thujone增强CD3AK细胞增殖及杀伤功能

目的:研究α-Thujone对CD3AK细胞增殖及杀伤功能的影响。方法:从人外周血来源的PBMC按常规方法培养成CD3AK细胞,用不同浓度的α-Thujone处理CD3AK细胞,CCK-8法检测CD3AK细胞增殖及其对K562、SW480、HO8910三株肿瘤细胞的杀伤情况。FCM检测经α-Thujone处理后CD3+CD8+T细胞上CD107a的表达。结果:α-Thujone能显著促进CD3AK细胞的增殖,表现出一定的浓度依赖性。α-Thujone还能促进细胞CD107a的表达和对多种肿瘤细胞的杀伤活性。结论:α-Thujone能促进CD3AK细胞增殖并增强其细胞毒性。

应用CD_3AK细胞预防肝癌术后复发的初步观察

目的：观察ＣＤ３ＡＫ细胞治疗对肝癌术后复发的影响。方法：６２例肝癌切除术按序号单双数的原则分为两组，研究组３２例术后１周开始应用ＣＤ３ＡＫ细胞治疗，每隔２～３个月施行一疗程，共２～６个疗程；对照组３０例术后不用ＣＤ３ＡＫ细胞治疗，仅作一般护肝治疗。结果：①研究组术后１年复发率为６．３％（２／３２）明显低于对照组２６．７％（８／３０）（Ｐ＜０．０５）；②研究组和对照组术后４周免疫功能测定有明显差异（Ｐ＜０．０５）。结论：术后应用ＣＤ３ＡＫ细胞对预防肝癌复发是一个有效的方法。

CD3+CD28抗体组诱导CD3AK细胞对肿瘤细胞杀伤效果的实验观察

CD3AK细胞是用于恶性肿瘤过继性免疫治疗的效应细胞之一,一般情况下即使小剂量的CD3抗体在白细胞介素-2（IL-2）的协同下也可诱导出具有杀伤活性的CD3AK细胞[1]。T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要机制,随着对抗原的识别和递呈、T细胞激活等免疫应答机制认识的不断深入,发现有效的抗肿瘤免疫反应必须在共刺激信号的参与下,将肿瘤抗原多肽递呈给T细胞而激发T细胞的免疫应答[2]。

肝癌患者自体CD3AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较

目的 比较肝癌患者自体 CD3AK细胞和 L AK细胞的杀伤活性 ,为临床应用提供依据。方法 以流式细胞仪检测细胞的杀伤活性。结果 原发性肝癌患者自体的 CD3AK细胞的 NK活性和 L AK活性均高于 L AK细胞。结论 CD3AK细胞效果稳定 ,抗瘤效应明显高于 L AK细胞 ,CD3AK细胞可望作为一种新的生物治疗手段用于肿瘤治疗。

CD_3AK细胞抗肿瘤作用与MHC限制性关系

目的 研究抗CD3 单克隆抗体激活的杀伤细胞 (anti-CD3 McAbactivatedkillercells ,CD3 AK细胞 )杀伤肿瘤细胞作用与MHC限制性的关系。方法 采用微量淋巴细胞毒实验方法测定CD3 AK细胞及肿瘤细胞MHC表型 ,用MTT法测定CD3 AK细胞杀伤活性。结果 (1)不同人来源的CD3 AK细胞 ,其MHC表型不同 ,但对同种肿瘤传代细胞都有很强的杀伤作用 ,且不同人来源的CD3 AK细胞间杀伤作用差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;(2 )同一来源CD3 AK细胞对不同肿瘤传代细胞株 (MHC表型不同 )的杀伤作用差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;(3)人外周血诱导的CD3 AK细胞对鼠肿瘤细胞株 (Yac - 1)与对人肿瘤传代细胞株 (K - 5 6 2 ,Raji)一样具有很强的杀伤作用。结论 CD3 AK细胞杀伤肿瘤的作用是非MHC限制的 ,在临床应用中可用正常人外周血诱导得到的CD3 AK细胞体外培养增殖后输给肿瘤病人进行治疗。该效应细胞来源方便 ,可用于肿瘤术后清除残留肿瘤细胞 ,具有重要应用价值。