淋巴结核患者外周血CD4^+CD25^(high)FoxP3^+调节性T淋巴细胞以及血浆IFN-γ和IL-10水平及其临床意义

目的研究淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+调节性T淋巴细胞(Treg)和干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)水平的变化及临床意义。方法采用流式细胞仪对100例淋巴结核患者及30名正常人外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平进行检测。结果淋巴结核患者组与正常对照组比较,外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IL-10水平均升高(P<0.05),而IFN-γ水平则降低(P<0.05)。在干酪样型、增殖型和混合型3种类型的淋巴结核病之间各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论淋巴结核患者细胞免疫功能明显异常。CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10在淋巴结核的发病过程中发挥了重要作用。

乳腺癌CD4^+ CD25^(high) Foxp^(3+)调节性T细胞数量和分布及Foxp3mRNA表达与肿瘤分期的相关性研究

目的研究乳腺癌患者CD4+CD25high Foxp3+调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)的存在数量、分布情况,及其功能基因Foxp3mRNA的表达变化与国际抗癌联盟(UICC)乳腺癌的TNM分期的关系。方法用四色流式细胞术以Foxp3-FITC/CD25-PE/CD4-PerCP/CD3-PC7抗体组合分析40名健康对照者及40例乳腺癌患者(临床TNM分期T1期9例、T2期10例、T3期12例、T4期9例)外周血、肿瘤组织浸润淋巴细胞(TIL)及癌旁淋巴结中CD4+CD25high Foxp3+Treg的数量及分布情况。实时荧光定量PCR技术检测TregFoxp3mRNA表达水平。结果乳腺癌患者外周血CD4+CD25high Foxp3+Treg占CD4T细胞的百分比为(8.91±3.06)%,高于正常健康对照组(5.84±2.63)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌患者TIL、癌旁淋巴结中Treg占CD4+T淋巴细胞比例均高于外周血,差异有统计学意义(P均<0.01)。乳腺癌组织TIL和癌旁淋巴结中Treg的Foxp3平均荧光强度(MFI)显著高于外周血(P<0.05)。T1、T2、T3、T4期乳腺癌患者Treg比例分别为(5.81±1.89)%、(6.52±2.15)%、(9.65±3.14)%、(11.86±2.43)%。乳腺癌患者外周血单个核细胞Foxp3mRNA表达水平明显高于健康对照组(P<0.01)。相关分析显示,Treg数量与肿瘤TNM分期显著相关(r=0.7 576,P<0.01);Foxp3基因mRNA表达水平与乳腺癌TNM各分期呈显著相关性(r=0.6 129,P<0.05)。结论乳腺癌患者CD4+CD25high Foxp3+Treg的数量升高,其增高程度与肿瘤临床分期呈显著正相关。乳腺癌患者外周血和癌组织局部Treg的数量、分布情况及特异性转录因子Foxp3mRNA的表达强度均有所不同,提示这可能是产生肿瘤免疫抑制的重要机制,CD4+CD25high Foxp3+Treg将来可作为乳腺癌患者病情进展的重要判断指标之一。

结直肠癌患者外周血CD4^+ CD25^(high)调节性T细胞的作用

目的探讨结直肠癌患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞(Treg)的作用。方法采用流式细胞仪测定36例结直肠癌患者及30例健康对照者外周血中CD4+CD25highFoxP3 Treg、CD4+CD25highTreg、CD4+CTLA-4 Treg及CD4+T细胞水平。结果与健康对照组比较,结直肠癌组患者外周血CD4+CD25highFoxP3 Treg显著增多(P<0.01),CD4+CD25high Treg和CD4+CTLA-4 T细胞也增多(P<0.05)。结论CD4+CD25highFoxP3 Treg可能在结直肠癌发展过程中起着重要作用。

帕金森病大鼠CD4^+CD25^(high)FoxP_3^+调节性T细胞的变化

目的研究帕金森病(Parkinson’s disease,PD)大鼠外周血中调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的改变,并探讨其与脑内免疫炎症反应的相关性。方法SD大鼠随机分为对照组、假手术组、PD 4周组、PD 2周组。PD 4周组和2周组定向注射6-羟多巴建立PD大鼠模型,假手术组注射PBS缓冲液,PD 2周组于术后第2周,其他组于术后第4周时,应用免疫荧光染色法观察各组大鼠黑质处酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元、离子钙接头蛋白分子-1(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,iba-1)和胶原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)阳性细胞数量及形态的改变,并通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测其外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴细胞比例的变化。结果PD4周组TH阳性神经元偏侧毁损率(91.33%±8.53%)较对照组和假手术组增加(P<0.01),且较PD2周组(64.56%±17.94%)毁损更为严重(P<0.05)。PD4周组iba-1阳性细胞增加率(82.60%±11.52%)和GFAP阳性细胞增加率(86.62%±6.80%)较对照组及假手术组均增加(P<0.01),但PD 4周组较2周组iba-1阳性细胞增加率(104.89%±13.39%)和GFAP阳性细胞增加率(117.92%±15.34%)均减少(P<0.05)。FCM示PD4周组大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴细胞的比例(0.64%±0.08%)较对照组、假手术组及PD2周组均降低(P<0.01)。另外,外周血T淋巴细胞中Treg比例变化与TH阳性神经元毁损率(r=-0.59,P<0.01)、iba-1阳性细胞增加率(r=-0.87,P<0.01)和GFAP阳性细胞增加率(r=-0.89,P<0.01)均呈负相关。结论PD大鼠外周血中Treg比例减少且可能与脑内免疫炎症反应相关。

CD4^+CD25^(high)FoxP3^+Treg与帕金森病干细胞移植后排斥反应间的相关性研究

目的通过应用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠,检测大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)比例的变化及相关细胞因子的漂移,观察脑内免疫排斥反应的发生状况。以期探讨干细胞移植治疗PD后,外周血中Treg的改变与脑内免疫排斥反应间的相关性及其在干细胞移植后免疫耐受中的作用。方法 SD大鼠随机分为正常对照组、PD组、(PD+PBS)组、(PD+BMSCs)组。正常对照组大鼠不进行任何处理,为完全空白对照;余下大鼠均通过脑内立体定向注射6-羟基多巴胺(6-hydmxydopamine,6-OHDA)建立PD大鼠模型。成功建模后第3周,(PD+PBS)组大鼠脑内定向注射PBS缓冲液;(PD+BMSCs)组大鼠脑内定向注射应用全骨髓贴壁法培养的大鼠BMSCs悬液;PD组大鼠不做任何处理。PBS缓冲液和BMSCs悬液注射2周后,各组大鼠均应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测其外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴细胞比例的变化,并运用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测外周血中白介素(IL)-4、IL-10和干扰素-γ(INF-γ)等相关细胞因子的改变。另外,通过免疫组织化学染色法观察大鼠脑内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元、离子钙接头蛋白分子-1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1,iba-1)阳性细胞、主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)分子的变化。同时,(PD+BMSCs)组大鼠采用EdU染色法监测移植后BMSCs的存活情况。结果脑内立体定向注射6-OHDA 3周后,部分大鼠腹腔注射阿扑吗啡可诱导出旋转行为,表现为向健侧旋转,呈首尾相接状,以210圈/30分钟为标准,建模成功率达65.45%,并且免疫组织化学染色显示,建模成功的PD大鼠偏侧TH阳性神经元毁损率可达90%以上。体外培养的大鼠BMSCs至P4时,细胞形态良好且均一,经流式细胞术鉴定,其纯度达95%以上。应用P4的BMSCs移植治疗PD大鼠2周后,BMSCs可在移植注射部位少量存活,但无法自我分化为多巴胺(dopamine,DA)能神经元,且(PD+BMSCs)组大鼠阿扑吗啡诱导旋转行为较PD组、(PD+PBS)组未见好转。另外,FCM示(PD+BMSCs)组大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴比例为(0.45±0.10)%,较正常对照组、PD组及(PD+PBS)组均显著减少(P<0.01)。ELISA示(PD+BMSCs)组大鼠外周血中IL-4、IL-10和INF-γ水平也较其他对照组显著降低(P<0.01)。同时,(PD+BMSCs)组大鼠脑内iba-1阳性细胞在移植处增生激活,MHC-Ⅱ类抗原分子表达上调,且二者与正常对照组、PD组及(PD+PBS)组相比均显著增加(P<0.01)。另外,进一步分析发现大鼠外周血中Treg比例与iba-1阳性细胞增加率、MHC-Ⅱ类抗原分子表达量均呈负相关(P<0.01)。结论本研究通过立体定向注射6-OHDA建立PD的大鼠模型,并给予脑内注射体外培养至P4的BMSCs移植治疗。此为基础,笔者验证了体外未经诱导分化的BMSCs移植治疗PD大鼠后无法自我分化为DA能神经元,甚至还可引起脑内免疫排斥反应,导致最终的治疗失败。另外,BMSCs移植治疗PD大鼠后外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg比例显著降低、相关细胞因子水平也明显下降,并且这些改变与移植后脑内免疫排斥反应的发生相关。

系统性红斑狼疮患者CD200/CD200R的表达及其在Treg/Th17细胞平衡中的作用

目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者CD200/CD200R1的表达,探讨CD200/CD200R1信号对Th17/Treg平衡的影响。方法用流式细胞仪检测53例SLE患者及24名健康对照者CD4+T细胞以及树突细胞表面CD200和CD200R1的表达,用酶联免疫吸附试验检测受试者血清游离CD200水平。通过体外细胞刺激培养观察CD200/CD200R1信号对Th17分化及调节性T细胞Treg生成的影响。结果 SLE患者CD4+T细胞、树突细胞CD200的表达及血清游离CD200水平均显著高于健康对照者,差异有统计学意义(P<0.05);CD200R1显著低于健康对照者,差异亦有统计学意义(P<0.05)。体外细胞培养给予CD200-Fc融合蛋白可降低SLE患者Th17的分化并纠正TGF-β诱导的调节T细胞生成缺陷。结论 SLE患者CD200和CD200R1表达异常,CD200/CD200R1信号在Th17/Treg平衡中具有重要作用。

系统性红斑狼疮患者外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞数量和Foxp3mRNA的表达水平与疾病活动性的相关性

目的研究系统性红斑狼疮（SEE）患者CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞的数量及其功能基因FoxD3mRNA的表达水平与SLE疾病活动性和肾脏损伤的相关性。方法采用四色流式细胞术以Foxp3-异硫氰酸荧光素（FITC）／CD2-藻红蛋白／CD4-多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）／CD3一藻蓝蛋白7抗体组合检测40名健康对照者及42例SLE患者外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞的数量，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测特异性转录因子Foxp3mRNA的表达水平，并分析其与SLE患者疾病活动指数（SLEDAI）、补体c3及血清抗双链DNA（dsDNA）抗体的关系。统计学方法采用￡检验和Spearman相关分析。结果活动期SLE患者外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞数量显著低于健康对照组[（4±3）％与（7±4）％，P〈0．05]，稳定期与健康对照组差异无统计学意义（P〉0．05）；活动期SLE患者外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞数量及CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞／CD4＋比值显著低于稳定期患者[（4±3）％，（9±6）％与（5±4）％，（10±6）％，P均〈0．05]；活动期SLE患者外周血Foxp3mRNA的表达水平明显低于稳定期和对照组（P〈0．01，P〈0．05）；SLE患者并发肾病组外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞数量及CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞／CD4＋比值显著低于SLE非肾病组（P〈0．05）。相关分析显示，SLE患者外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞数量与SLEDAI呈负相关（r=-0．5782，P〈0．05）；CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞／CD4＋比值与SLEDAI呈负相关（r=-0．4913，P〈0．05），与补体c3呈正相关（r=0．3687，P〈0．05）；SLE患者外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞数量与Foxp3mRNA的表达水平呈正相关（r=0．6142，P〈0．01）。结论SLE患者外周血CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞和Foxp3mRNA的变化可能是导致SLE疾病发生和发展的关键因素之一，与疾病的活动性有密切关系。

CD39和CD73在CD4^+CD25^(high)Foxp3^+调节性T细胞发挥免疫抑制功能中的作用研究

本研究旨在检测正常人CD4^+CD25^(high)Foxp3^+Treg表面腺苷代谢分子的表达,并探索该分子在CD4^+CD25^(high)Foxp3^+Treg发挥抑制功能中的作用。采用流式细胞术检测10例健康献血者外周CD4^+CD25^(high) Foxp3^+Treg表面腺苷代谢分子CD39、CD73的表达,免疫组化染色检测了5例健康人皮肤中腺苷代谢分子CD39、CD73及Foxp3的表达。对5例健康献血者,流式细胞仪分选得到CD4^+CD25^(high)、CD4^+CD25^(high) CD39^+、CD4^+CD25^(high) CD39^+CD73^+共3部分细胞,采用3H-TdR掺入方法检测这3部分T细胞对CD4^+CD25-T细胞增殖的抑制作用。同样采用流式细胞术对10例斑块型银屑病患者外周CD4^+CD25^(high)Foxp3^+Treg表面CD39和CD73分子的表达进行分析。结果显示,正常人外周血CD4^+CD25^(high) Foxp3^+Treg与CD4^+CD25mid和CD4^+CD25-T细胞相比,CD39明显高表达(P<0.01),CD73低表达(P<0.05)。正常人皮肤中,CD39主要表达在表皮角质形成细胞,而CD73则主要分布于真皮中。CD39^+CD73^+Treg对CD4^+CD25-T细胞增殖的抑制最强(P<0.01)。银屑病患者外周血CD73^+CD4^+CD25^(high)Foxp3^+Treg比例较正常人明显降低(P<0.01)。由此推测腺苷代谢分子是CD4^+CD25^(high)Foxp3^+Treg发挥抑制功能的重要物质,并可能参与银屑病的发生。

重型再生障碍性贫血患儿外周血CD4^+CD_(25)^(high)Foxp3^+Treg细胞与CD5^+B细胞的相关性

目的探讨重型再生障碍性贫血(SAA)患儿外周血CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞与CD5+B细胞的变化及其相关性。方法收集36例SAA患儿(SAA组)及60例健康体检儿童(健康对照组),采用流式细胞术检测二组外周血CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞与CD5+B细胞水平,并进行比较,同时分析SAA组此2种细胞数量的相关性;将免疫抑制治疗后有效的SAA患者划为治疗有效组,检测其CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞与CD5+B细胞水平,并与治疗前进行比较,了解其变化趋势。结果SAA患儿外周血CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞比例[(1.56±0.77)%]显著低于健康对照组[(3.73±0.93)%](P<0.01);CD5+B细胞比例在SAA组为(21.47±6.89)%,显著高于健康对照组[(12.21±6.18)%](P<0.01);SAA组CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞比例与CD5+B细胞比例呈显著负相关(P<0.01)。治疗有效组CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞比例为(2.62±0.75)%,较治疗前明显回升(P<0.05),但仍较健康对照组低(P<0.05);CD5+B细胞比例为(11.75±8.12)%,较治疗前显著下降(P<0.01)。结论CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞与CD5+B细胞的比例改变可能参与儿童SAA的发病,CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞的比例下降可能与CD5+B细胞的增高有关。

胃癌患者外周血中CD4^+CD25^(high)FOXP3^+调节性T细胞的检测及临床意义

目的探讨胃癌患者外周血CD4+CD25highFOXP3+调节性T细胞(Treg)的检测及临床意义。方法选取60例胃癌患者(胃癌组)和60例健康体检者(健康对照组),采用流式细胞仪检测外周血中CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞、CD4+CD25highT细胞及CD4+T细胞水平,酶联免疫吸附法检测外周血白介素10(IL-10)和转化生长因子β1(TGF-β1)浓度。结果与健康对照组相比,胃癌组患者外周血中CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞和CD4+CD25highT细胞比例增高;IL-10和TGF-β1浓度增高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞可能与胃癌发生发展密切相关,为胃癌免疫治疗提供新思路。

天然调节T细胞与结核病免疫病理关联

目的 检测调节性T细胞（Tr）在结核病病人是否增高,确证Tr与结核免疫病理的关联性,为Tr功能研究提供疾病模型.方法 流式细胞术（FACS）分选CD3＋CD4＋T及CD3＋CD8＋T等主要淋巴细胞亚群,通过RT-PCR测定Foxp3基因在正常和结核病病人T细胞亚群中的表达,FACS多色分析Foxp3 T细胞在CD4＋CD25＋细胞群体中的分布,累积病例分析Tr细胞在外周血扩增情况,免疫组化方法分析Tr在结核病理的浸润,结合临床资料分析Tr数量的改变与结核病的关联性.结果 Foxp3基因在正常和结核病病人CD3＋ CD4＋T细胞中特异性扩增,FACS分析表明foxp3主要表达于CD4＋ CD25high亚群中,占CD4＋ CD25highT细胞的80%以上,以CD4＋CD2high Foxp3＋三联标志检测40例正常与51例活动性结核病病人外周血Tr占CD4＋T细胞比例分别为（0.23±0.20）%和（1.01±1.00）%,结核病病人较正常人高4.4倍,Tr在结核病明显扩增（P〈0.01）,结核病理组织中有高频率Foxp3＋细胞浸润.Tr扩增与结核病有效治疗和预后的关联性有深入探讨价值.结论 Tr细胞在结核病病人增高,并与结核免疫病理损伤相关,结核病可作为Tr细胞功能研究的疾病模型.