猪CD4分子的全长cDNA克隆与序列分析

CD 4分子为动物辅助性T细胞(TH)和部分胸腺细胞的共受体与信号传导分子,参与TCR介导的TH细胞活化和胸腺细胞分化过程。本研究应用RT-PCR和RACE技术从猪胸腺细胞总RNA中扩增克隆了猪CD 4全长cDNA序列,并进行了序列特性分析。序列分析结果表明,在猪胸腺细胞和外周血淋巴细胞中存在2种方式剪接的CD 4 mRNA转录本,其中一种mRNA转录本缺失编码40个氨基酸残基的120 n t序列,提示该转录本可能编码猪分泌型CD 4分子;猪CD 4全长cDNA序列为2 715 n t,其中5′非编码区159 n t,3′非编码区1 183 n t,1 374 n t的开放阅读框编码457个氨基酸的猪CD 4前体蛋白(含4个糖基化位点);猪CD 4分子的7个Cys残基(Cys43、Cys122、Cys327、Cys418、Cys421、Cys444和Cys446)和2个Ser残基(Ser432和Ser439)在动物种间保守;在猪CD 4分子胞浆区,存在高度保守的S rc家族蛋白酪氨酸激酶p56lck识别位点KKTCQC和内化相关双亮氨酸基序。推导氨基酸序列分析结果显示,猪与人、兔、猫、狗和鼠CD 4蛋白的氨基酸同源性分别为56.0%,54.5%,56.9%,56.5%和44.9%。

鸡CD4和CD8α基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

用Trizol提取6周龄白莱航鸡胸腺组织的总RNA,再用Oligo-dT纤维素富集mRNA后,用RT-PCR分别扩增出鸡CD4和CD8α基因cDNA。PCR产物切胶回收后连入T载体,测序正确后再连入pcDNA3.1(+)。将重组质粒pcDNA3.1-CD4和pcDNA3.1-CD8分别转染COS-7细胞,用已知的抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体检测到转染细胞中CD4和CD8α分子的表达,这说明构建的真核表达质粒正确,为下一步用DNA免疫方法研制抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体以及研究鸡CD4和CD8分子的结构和功能打下基础。

中国部分地方品种鸡CD4和CD8α基因cDNA的克隆与序列分析

用Trizol分别提取4～6周龄白莱航鸡、狼山鸡、大骨鸡、北京油鸡、仙居鸡、茶花鸡、固始鸡和隐性白羽鸡胸腺细胞的总RNA，再用Oligo-dT纤维索富集mRNA后，用RT-PCR分别扩增出鸡CD4和cD8α基因cDNA。将PCR产物克隆进T载体后测序。序列分析显示不同品种鸡的CD4 cDNA序列完全一致；中国地方品种鸡与国外品种的白莱航鸡、RPL7系鸡在CD8α胞外区有6～13个氨基酸的差异，仙居鸡与其他5个中国地方品种鸡在CD8α胞外区有4～5个氨基酸的差异，狼山鸡、北京油鸡和隐性白羽鸡CD8α cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列完全一致。这些结果表明，中国地方品种鸡CD4基因序列高度保守；中国地方品种鸡与国外品种鸡的CD8α cDNA序列之间具有遗传多态性，而中国地方品种鸡之间CDSα cDNA序列遗传多态性低，为进一步研究CD4分子和CD8α链的结构和功能提供了条件。

HIV受体CD_4V_2-V_2区段基因的PCR扩增、克隆及表达

设计“链扩增致表达框架法”改良聚合酶链扩增(PCR)技术以获得CD_4基因的V_1-V_2区段,使原不完整的真核基因区段强制性地修饰成有表达可能的完整基因,并保持原读码框架的正确性。该扩增片段经序列分析确证后,克隆入表达载体pLSD_(13)(含P_L强启动子)和pBV220(含P_RP_L融合启动子)中。Southern杂交证实了这种插入的正确性,SDS/PAGE检测诱导表达的结果,获得一个分子量为2.03×10~4的蛋白带,证实为CD_4 V_1-V_2区蛋白。