CD40L在CD4^＋CIK诱导Fas抵抗乳腺癌细胞凋亡中的机制研究

目的:探讨CD40/CD40L交联在诱导Fas抵抗乳腺癌细胞凋亡中的免疫学机制。方法:体外大规模扩增自体CIKs细胞,利用磁珠分选系统纯化其中CD4+T细胞亚群(CD4+CIK)。用抗Fas激活性抗体CH11诱导乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞凋亡,比较有无CD4+CIK培养上清预处理对MDA-MB-231细胞凋亡率的影响。MDA-MB-231细胞与CD4+CIK在不同效靶比下共孵育6小时和24小时,分别用流式细胞仪检测凋亡率和膜Fas表达,定量RT-PCR法检测胞浆内Bax、Bcl-2、FADD和c-FLIP的mRNA含量。在共培养系统中加入抗FasL、抗CD40L和抗IFN-γ中和抗体,分别比较MDA-MB-231细胞凋亡率、膜Fas表达和四种凋亡相关基因的mRNA含量。结果:MDA-MB-231细胞对CH11诱导的凋亡有抵抗,但经过CD4+CIK培养上清预处理后,敏感性显著提高。MDA-MB-231细胞与CD4+CIK共孵育24小时后,细胞凋亡率明显升高,并与膜Fas表达量呈正相关(r=0.618,P<0.01)。在共培养体系中添加抗FasL和抗CD40L中和抗体可完全清除增加的细胞凋亡,而抗IFN-γ中和抗体只能部分清除,凋亡率分别从(33.70±2.77)%降至(7.57±1.15)%、(7.80±0.26)%和(14.21±1.70)%。但MDA-MB-231细胞膜Fas表达可以等效地被抗CD40L和抗IFN-γ中和抗体封闭,分别从(25.90±2.45)%降至(6.93±1.56)%和(8.73±4.70)%。定量RT-PCR结果显示MDA-MB-231细胞与CD4+CIK共孵育6小时时胞浆中c-FLIP表达下降与凋亡率显著相关(r=0.898,P<0.05),而抗CD40L中和抗体可诱导c-FLIP表达升高。结论:CD40/CD40L交联和IFN-γ刺激均参与了CD4+CIK诱导的MDA-MB-231细胞凋亡,但其Fas抵抗性的逆转主要是通过CD40/CD40L交联抑制c-FLIP的mRNA合成而实现的。

CIK细胞中CD4^+T细胞亚群抗肿瘤免疫活性

目的 :观察CIK细胞中CD4 + T细胞亚群抗肿瘤免疫活性。方法 :体外大规模扩增CIK细胞 ,利用磁珠分离系统富集纯化CIK细胞中的CD4 + T细胞亚群。采用胞内染色法分析其中Th1/Th2的比例变化 ;LDH法和荧光染色法比较 4h和 2 0h其对raji细胞的杀伤率和raji凋亡。 结果 :经磁珠分离法富集的CD4 + CIK细胞纯度高达 96 % ,其中Th1/Th2的分布较PBMC有显著的改变 :Th1亚群、Th0亚群明显升高 ,Th2亚群无显著变化。CD4 + CIK细胞虽然不能在 4h之内溶解raji细胞 ,但可在 2 0h时产生同CD4 -CIK细胞同样强大的杀伤活性 ,荧光染色可见其在 4h之内诱导raji出现早期凋亡的迹象。 结论 :本研究提示CD4 + CIK细胞具有明显的“Th1优势”可以调节宿主免疫细胞活性 ;同时CD4 + CIK细胞可通过诱导肿瘤细胞凋亡实现对肿瘤的抑制和杀伤。

DC-CIK对胃癌合并腹水患者外周血CD4^+CD25^+调节性T细胞增殖及功能的影响

目的:探讨DC-CIK对胃癌合并腹水患者外周血CD4^+CD25^+调节性T胞(Treg细胞)比例及功能的影响。方法:60例胃癌合并腹水患者,于输注DC-CIK前1天及DC-CIK治疗结束后1周分别采集外周血。流式细胞术检测外周血Treg细胞的比例,RT-PCR法检测其Foxp3mRNA表达情况;将分选出的Treg细胞和CD4^+CD25^-T细胞分为单纯Treg细胞组(A组)、1∶1混合培养(B组)、单纯CD4^+CD25^-细胞组(C组)进行培养,~3H-TdR掺入法检测Treg细胞抑制CD4^+CD25^-细胞增殖的能力。结果:治疗后外周血Treg细胞占CD4^+T细胞的比例较疗前显著下降[(6.21±1.37)%vs(9.38±1.06)%,P<0.05]。治疗后Treg细胞Foxp3mRNA表达水平较治疗前显著下降[(56.18±13.25)%vs(85.26±11.58)%,P<0.05]。治疗后Treg对CD4^+CD25^-T细胞抑制增殖能力较治疗前明显下降[(37.31±4.16)%vs(48.92±5.25)%,P<0.05]。结论:输注DC-CIK免疫治疗,可显著降低胃癌合并腹水患者外周血Treg细胞比例,下调Foxp3mRNA表达水平,降低Treg细胞免疫抑制功能,有利于诱导抗肿瘤免疫效应。

CD40/CD40L交联在CD4^+ T细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的机制研究

目的:探讨CD40/CD40L交联在CIK细胞中CD4+T细胞(CD4+CIK)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制。方法:体外扩增CIK细胞并纯化CD4+T细胞亚群,AnnexinV染色法观察CD4+CIK诱导肿瘤细胞凋亡的作用;半定量PCR、流式细胞法及ELISA法比较CD4+CIK激活前后CD40L的表达变化;将转染质粒pIRES2-EGFP-sCD40L的CHO细胞(CHO-sCD40L)与乳腺癌细胞T47D共孵育,监测24小时后其表面分子Fas的表达变化及对Fas介导凋亡的敏感性。结果:CD4+CIK细胞可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡率随孵育时间和效靶比的升高而增加,且肿瘤细胞表面分子Fas水平升高,可从1.98%±0.23%升高到31.62%±7.07%;CD4+CIK细胞被激活后,CD40L表达水平均较激活前明显增加;成功转染的CHO-sCD40L细胞与T47D共培养后,T47D表面分子Fas可被诱导升高,加入CH-1124小时后可观察到明显T47D细胞的凋亡。结论:CD4+CIK可能通过CD40/CD40L交联提升肿瘤细胞表面功能性Fas表达来诱导其凋亡。

CD4^+T细胞在抗肿瘤过继性免疫治疗中作用的研究

目的:观察CIK细胞中CD4+T细胞中Th1/Th2亚群分布情况。方法:体外大规模扩增CIK细胞,磁珠法纯化其中CD4+T细胞。采用胞内染色、ELISA和荧光定量RT-PCR法检测培养前后Th1/Th2细胞亚群的比例、Th1/Th2类细胞因子的分泌量和基因表达的变化。结果:富集CD4+细胞纯度达96%,CIK中Th1亚群和Th0亚群的比例较PBMC显著升高(P<0.05),而Th2亚群无显著变化。CD4+CIK细胞中IL-2和IFN-γ等Th1类细胞因子释放量增高(P<0.01),而IL-10和TGF-"等Th2类细胞因子释放量降低(P<0.05)。但CD4+CIK细胞中除IFN-γ的mRNA显著升高外(P<0.05),IL-2和IL-4的mRNA变化不明显。结论:CIK细胞中的CD4+T细胞具有明显的Th1优势。