颈动脉粥样硬化斑块CD40、MMP9的表达及意义

目的:观察CD40及基质金属蛋白酶-9(MMP9)在人颈动脉粥样硬化斑块中的表达,探讨CD40在斑块稳定性中的作用及可能机制。方法:将因颈动脉粥样硬化狭窄(>70%)行颈动脉内膜切除术的28例手术标本分为有临床卒中事件组(n=15)和无临床卒中事件组(n=13),另设尸检无动脉粥样硬化的正常颈动脉(n=8)作为对照组,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测各组斑块中CD40和MMP9 mRNA水平,Western印迹检测各组CD40和MMP9蛋白表达水平,并对CD40与MMP9基因的表达作相关性分析。结果:无临床卒中事件组和有临床卒中事件组的CD40、MMP9基因的表达较正常对照组明显增高(P<0.01),有临床卒中事件组明显高于无临床卒中事件组(P<0.01),CD40与MMP9 mRNA表达有正的直线相关关系(r=0.964,P<0.01)。正常颈动脉中MMP9和CD40蛋白基本不表达;颈动脉粥样硬化斑块中MMP9和CD40蛋白表达较正常颈动脉明显增高;有卒中事件组颈动脉斑块MMP9和CD40蛋白表达高于无卒中事件组。结论:颈动脉粥样硬化斑块中CD40、MMP9表达增高,可能与斑块的稳定性密切相关。

CD40-CD40L共同表达于人内皮细胞及人动脉粥样斑块中

目的 :探讨CD4 0和CD4 0L在人脐静脉内皮细胞及动脉粥样硬化斑块中是否可共同表达。方法 :CD4 0及CD4 0L在内皮细胞表面的表达分别采用荧光技术、RT -PCR、流式细胞仪和Westernblotting检测。人的动脉粥样硬化斑块中CD4 0及CD4 0L的表达采用免疫组化方法。结果 :人内皮细胞能连续表达CD4 0及CD4 0LmRNA和蛋白 ,并且细胞因子IL - 1β、IL - 6、TNF -α、INF -γ能明显刺激内皮细胞表达CD4 0、CD4 0L。人动脉粥样斑块中能共同表达CD4 0及CD4 0L ,而动脉壁的其它部分不表达。CD4 0L主要表达在斑块的肩部和底部 ,CD4 0在斑块中表达广泛。结论 :人内皮细胞表面及粥样斑块中能共同高表达CD4 0和CD4 0L ,提示CD4 0及CD4 0L相互作用在动脉粥样硬化形成及发展中起重要作用。

结肠癌组织中CD40蛋白表达及其生物学意义

目的:研究免疫共刺激分子CD40在结肠癌及癌旁组织中的表达情况及其生物学意义。方法:应用免疫组织化学技术检测65例结肠癌组织和10例癌旁组织中CD40蛋白的表达,并分析CD40表达水平与临床病理特征的相关性。结果:免疫组织化学检测结果显示,CD40蛋白阳性染色于细胞膜和细胞质,在结肠癌组织中高表达率为41.5%,而在正常癌旁组织中不表达,差异有统计学意义(P<0.05)。CD40蛋白表达与肿瘤TNM分级和淋巴结转移显著相关(P<0.05),与患者年龄、性别及肿瘤大小无相关性(P>0.05)。结论:CD40分子可能在结肠癌发病过程中起重要作用,可作为结肠癌预后判断及淋巴结转移监测的有价值的指标之一。

计算机模建和点突变分析抗人CD40单克隆抗体5C11识别的抗原表位

目的:通过计算机模拟与点突变实验初步探讨本课题组前期研制的抗人CD40激发型单克隆抗体5C11识别的抗原表位。方法:利用InsightⅡ软件分别模拟抗原、抗体结构,构建抗原抗体复合物模型,通过计算推测5C11单抗所识别的抗原表位。构建人野生型CD40(wtCD40)及其第70位苏氨酸突变型(70muCD40)和第114位谷氨酸突变型(114muCD40)的重组真核表达载体pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40,脂质体转染法将重组载体导入HEK293细胞,筛选稳定转染细胞株(即HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞)。流式细胞术和Western blotting检测5C11单抗与HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞的结合能力。结果:成功构建pIRES2-EG-FP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40真核表达载体和相应稳定转染细胞株。5C11单抗与HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞结合能力较HEK293/wtCD40细胞明显减弱;Western blotting检测结果表明,5C11单抗仅识别HEK293/wtCD40细胞,不识别HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞。结论:人CD40氨基酸序列的第70位苏氨酸和第114位谷氨酸是其单抗5C11识别的抗原表位,对构建人源化CD40抗体具有潜在的临床意义。

腹透液增强腹膜间皮细胞CD40表达及其意义

目的 :研究腹膜透析液对大鼠腹膜间皮细胞CD40表达的影响及CD40活化后与细胞间粘附分子 - 1(ICAM - 1)分泌的相关性 ,以揭示腹膜透析时腹腔局部炎症的发生机制。方法 :分离、培养大鼠腹膜间皮细胞 ,分别用IFN -γ、4 2 5 %腹透液、4 2 5 %腹透液 +IFN -γ作为刺激因子 ,通过逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)及流式细胞仪 (FACS)检测间皮细胞CD40表达 ;并通过CD40单克隆抗体 (CD40mAb)活化高表达的间皮细胞CD40 ,用FACS检测间皮细胞ICAM - 1的表达。结果 :腹膜间皮细胞结构性表达低水平CD40mRNA及蛋白。用 4 2 5 %腹透液刺激后 ,间皮细胞CD40mRNA及蛋白的表达显著高于对照组。用 4 2 5 %腹透液 +IFN -γ刺激后 ,间皮细胞表面CD40mRNA及蛋白的表达进一步增加 ,且明显高于单纯腹透液刺激组。活化CD40受体可显著增强间皮细胞ICAM - 1的表达。结论 :腹膜间皮细胞可表达CD40 ,4 2 5 %透析液及IFN -γ均能显著增加腹膜间皮细胞CD40的表达。间皮细胞CD40的上调 ,可能是腹透过程中腹腔局部炎症启动。

普伐他汀和阿司匹林对CD40-CD40L表达及斑块稳定性的影响

目的:研究普伐他汀和阿司匹林对兔腹主动脉粥样硬化斑块CD40-CD40L表达及斑块稳定性的影响。方法:新西兰大白兔32只予高脂饲养16wk及腹主动脉球囊损伤术建立腹主动脉粥样硬化模型,分4组:P组(普伐他汀)、A组(阿司匹林)、A+P组(联合用药)与N组(不用药),分别予相应药物灌胃8wk。通过免疫组化检测比较各组兔腹主动脉粥样硬化斑块内CD40-CD40L表达、MMP-1、胶原及脂质含量变化,超声检测腹主动脉内膜-中膜厚度(IMT)改变,ELISA法测定血清C反应蛋白(CRP)变化,分析2药干预动脉粥样硬化斑块稳定性的机制。结果:用药各组兔腹主动脉斑块内CD40-CD40L表达较N组显著受抑,普伐他汀作用更显著(P组和A+P组均P<0.01);同时各用药组MMP-1的表达、IMT增厚及CRP增高较N组均得到明显抑制(P<0.01),P组和A+P组较N组斑块内脂质显著减少(P<0.01),胶原含量明显增加(P<0.01)。结论:普伐他汀和阿司匹林都可抑制斑块CD40-CD40L系统的表达,促进斑块的稳定性。普伐他汀促进斑块稳定的机制可能是多方面的。

冠状动脉斑块形态与CD40配体及妊娠相关蛋白酶-A的关系

目的 检测经冠状动脉造影显示为Ⅱ型斑块的冠心病患者血浆中CD4 0配体 (CD4 0L)和妊娠相关蛋白酶 A(PAPP A)水平 ,从临床角度探讨斑块破裂的原因。方法 对 6 8例经冠状动脉造影证实的冠心病患者的冠状动脉斑块形态进行分型。根据斑块形态 ,患者分为 4组 :Ⅰ型病变组 (表面光滑 ,n =1 9) ,Ⅱ型病变组 (表面不规则 ,n =33) ,Ⅲ型病变组 (长段表面不规则 ,n =1 6 ) ,另 2 5例冠状动脉造影正常的患者为对照组。所有患者检测血浆CD4 0L、PAPP A、心肌肌酸激酶 (CK)及肌酸激酶同工酶 (CK MB)。结果 Ⅱ型病变组血浆CD4 0L水平 [(3 2 1± 2 0 8)mg/L]显著高于Ⅰ型病变组[(1 0 3± 0 98)mg/L ,P <0 0 1 ]、Ⅲ型病变组 [(1 2 3± 0 88)mg/L ,P <0 0 5 ]和对照组 [(1 0 1± 0 94 )mg/L ,P <0 0 1 ]。Ⅱ型病变组血浆PAPP A[(1 6 8± 7 2 )mU/L]显著高于Ⅰ型病变组 [(7 3± 4 1 )mU/L ,P <0 0 1 ]、Ⅲ型病变组 [(8 9± 4 9)mU/L ,P <0 0 5 ]和对照组 [(7 1± 4 4)mU/L ,P <0 0 1 ]。Ⅱ型病变组血浆CD4 0L与PAPP A呈显著正相关 (r =0 44 6 ,P <0 0 1 )。结论 冠状动脉造影显示斑块破裂的冠心病患者血浆CD4 0L、PAPP A水平明显升高 ,且CD4 0L与PAPP A呈正相关。提示CD4 0L可能通过上调PAPP

大鼠心肌缺血再灌注损伤时粘附分子CD40及CD40配体的表达

目的 :探讨粘附分子CD4 0及CD4 0配体 (CD4 0L)在心肌缺血再灌注损伤中的表达。方法 :采用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型 ,大鼠分 7组 :对照组 (n =3)、单纯缺血 30min、缺血 30min再灌注 1min、5min、10min、2 0min和 30min组 (各组n =6 ) ,利用流式细胞技术观察外周血CD4 0及CD4 0L的表达 ,并用免疫组织化学法观察CD4 0及CD4 0L在心肌中表达情况。结果 :单纯 30min缺血组 (I3 0min)的CD4 0及CD4 0L高于对照组 (P <0 0 5 ) ;在不同的再灌注时间中 ,CD4 0及CD4 0L在再灌注 1min(R1min)开始升高 ,R5min达高峰 ,随后开始下降 ,R3 0min达基线 ,其中R5min、R10min的CD4 0及CD4 0L比I3 0min及对照组高 (P <0 0 5 ) ,免疫组织化学法显示CD4 0及CD4 0L在心肌细胞膜上表达 ,正常心肌细胞膜上表达较弱 ,损伤心肌细胞膜上表达较强。结论 :提示心肌缺血再灌注损伤的发生可能与粘附分子CD4 0及CD4

卡介菌多糖核酸对尖锐湿疣患者外周血单一核细胞表达CD40和CD40L的影响

目的探讨卡介菌多糖核酸(BCGPSN)对尖锐湿疣(CA)患者外周血单一核细胞(PBMC)表达CD40和CD40L的影响。方法利用流式细胞仪对CA患者BCGPSN组和对照组治疗前后及正常人PBMC中CD40和CD40L进行检测。结果治疗前CA患者PBMC中CD40和CD40L阳性细胞数较正常人显著降低(t=5.385,P<0.05;t=3.418,P<0.05);BCGPSN组治疗后PBMC中CD40和CD40L的阳性细胞百分数较治疗前显著升高(t=7.764,P<0.05;t=17.24,P<0.05);而对照组治疗前后CD40和CD40L水平差异无显著性,且复发率高于BCGPSN组。结论BCGPSN对CA患者PBMC的CD40和CD40L表达可能有调节作用。

Graves病甲亢和CD40基因单核苷酸多态性的相关性

目的:探讨CD40基因5′非翻译区域C/T多态性和Graves病(GD)甲亢发病的相关性。方法:采用序列特异性聚合酶链式反应-限制性内切酶酶切长度多态性(PCR-RFLP)方法分析106例GD甲亢患者和106例正常对照者CD40基因5′非翻译区域C/T多态性。结果:GD甲亢患者CC基因型明显高于正常对照组(49.1%vs32.1%),C等位基因频率明显高于正常对照组(63.7%vs50.5%)。结论:CD40基因5′非翻译区域的C等位基因和GD甲亢相关。

CD40在人腹膜间皮细胞的表达

目的 :对人腹膜间皮细胞CD40的表达及其调节因素进行初步探讨。方法 :从CAPD患者的透出液中分离、培养腹膜间皮细胞 ,用IFN -γ、TNF -α、IL - 1、LPS刺激 2 4h ,通过流式细胞仪 (FACS)检测分析腹膜间皮细胞CD40、CD40L及ICAM - 1的表达。结果 :腹膜间皮细胞结构性表达少量的CD40 ;IFN -γ可显著增加腹膜间皮细胞表面CD40蛋白的表达 ,而TNF -α、IL - 1、LPS对腹膜间皮细胞表面CD40蛋白的表达无显著影响。未见间皮细胞表达CD40L。IFN -γ、TNF -α、IL - 1、LPS对间皮细胞ICAM - 1表达均有显著增强作用。IFN -γ增强ICAM - 1表达作用显著高于TNF -α、IL - 1、LPS ,间皮细胞CD40表达强度与ICAM - 1呈显著正相关。结论 :人腹膜间皮细胞可功能性表达CD40。

白藜芦醇对内皮细胞CD40途径的影响

目的:观察白藜芦醇对内皮细胞CD40途径活化后CD40和E-选择素表达的影响。方法:白藜芦醇(10μmol/L)预孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后,以可溶性CD40配体(sCD40L,10μg/ml)刺激,流式细胞术检测内皮细胞E-选择素和CD40分子的表达,半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测E-选择素和CD40基因的转录。结果:sCD40L诱导内皮细胞E-选择素和CD40基因的显著转录和表达(P均<0.01),白藜芦醇显著抑制E-选择素和CD40基因的转录和表达(P<0.05～<0.01)。结论:结果提示白藜芦醇可能通过抑制CD40途径发挥抗动脉粥样硬化作用。

IL-4及CD40mAb对肾小管上皮细胞RANTES表达的影响

目的 :观察小鼠肾小管上皮细胞 (TEC)在IL - 4及CD4 0激活状态下激活正常T细胞表达和分泌因子 (RANTES)分泌的变化。方法 :刺激原代培养的小鼠肾小管上皮细胞 ,检测RANTES的表达 ,流式细胞仪检测CD4 0表达。结果 :(1)常规培养下 ,小鼠TEC可表达一定量的CD4 0 ,用IL - 4刺激TEC 2 4h ,细胞表面CD4 0MFI显著高于对照组 (P <0 0 1)。 (2 )常规培养下 ,小管上皮细胞仅分泌极少量的RANTES(14 78ng/L± 2 2 0ng/L) ,在IL - 4刺激或CD4 0mAb激活后TECRANTES蛋白分泌分别为 4 3 6 1± 13 73和 73 77± 4 2 8,显著高于对照组 (P <0 0 1)。用IL -4刺激肾小管细胞CD4 0表达的同时 ,加入纯化的CD4 0mAb激活CD4 0受体 ,TECRANTES的合成、分泌显著高于对照组 (131 77± 4 1 87,P <0 0 1) ,与单纯IL - 4刺激组及CD4 0mAb刺激组比较差异显著 (均P <0 0 1)。 (3)用IL - 4、CD4 0mAb及IL - 4 +CD4 0mAb刺激TEC细胞 2 4h ,各刺激组RANTESmRNA表达显著高于对照组 (P <0 0 5 )。结论 :IL - 4及CD4 0 -CD4 0L共刺激信号可调控RANTES合成及分泌 ,参与TEC炎症过程。

乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的设计和生物活性预测

目的:探讨乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白设计的合理性。方法:应用Gene Constructionkit2.5、DNAStar软件和www.expasy.org网站提供的分析方案分析重组体的开放读框以及融合蛋白的柔性、亲水性、抗原性、表位等性质,并作了二级结构模拟分析。结果:重组体CMV启动子下游有完整的目的基因ORF,融合蛋白二级结构水平未出现新的抗原性及表位,亲水性无改变,Linker部位抗原性低,呈中性且柔性高,不影响两端的蛋白质二级结构及融合蛋白空间构象。结论:重组体设计合理,融合蛋白很大可能保留了乙肝表面抗原和CD40L胞外段的生物学活性,为进一步研究提供了理论依据。

激发型CD40单抗对宫颈癌细胞株SiHa化疗敏感性的影响

目的:研究激发型CD40单抗(5C11)对宫颈癌细胞株SiHa化疗敏感性的影响及其机制。方法:采用流式细胞术检测宫颈癌细胞株SiHa上CD40分子的表达,用MTT法检测5C11联合化疗药物对SiHa细胞的作用,PI染色检测SiHa细胞周期的变化,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,RT-PCR方法分析单抗5C11作用SiHa细胞后凋亡基因表达水平变化。结果:宫颈癌细胞株SiHa高表达CD40,5C11和盐酸吉西他滨单独抑制细胞生长作用不明显,但两者联合能显著抑制SiHa生长和促进凋亡,SiHa细胞经5C11作用后出现S期阻滞,抗凋亡基因bcl-XL表达明显下调,促凋亡基因Bax的上调作用不明显。结论:CD40分子通过介导S期阻滞和调节凋亡基因表达水平增加SiHa细胞对盐酸吉西他滨化疗的敏感性。

microRNA-145通过CD40对泡沫细胞免疫炎症反应的影响

目的探讨microRNA(miR)-145通过CD40对泡沫细胞免疫炎症反应的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞,随机均分为模型组(不转染)、miR-145 mimics组(转染miR-145 mimics)、miR-145inhibitor组(转染miR-145 inhibitor)、沉默CD40序列组(转染si CD40),转染6 h之后,用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激24 h诱导形成泡沫细胞。应用real-time q PCR(RT-q PCR)和Western blot检测各组细胞中CD40 mRNA和蛋白的表达情况;ELISA法检测细胞上清液中炎症因子白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。结果与模型组相比,miR-145 mimics组CD40 mRNA、蛋白及IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平均明显下降(P<0.01);经miR-145抑制剂干预后,上述指标均较模型组和miR-145 mimics组升高(P<0.01);而转染沉默CD40序列后,CD40 mRNA、蛋白及IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平较miR-145抑制剂组均明显下降(P<0.01)。结论 miR-145可通过靶基因CD40调控泡沫细胞免疫炎症过程,抑制CD40/CD40L信号通路活化,抑制炎症反应。

肿瘤抗原联合CD40L致敏树突状细胞诱导CTLs杀伤K562细胞的实验研究

目的:以健康人外周血单核细胞为前体细胞,体外诱导为树突状细胞(DCs),负载K562细胞冻融抗原,并联合CD40L诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对K562细胞的杀伤作用。方法:密度梯度离心法、贴壁法分离健康人外周血单核细胞,应用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α等细胞因子诱导扩增,培养DCs,用K562细胞冻融抗原联合rhsCD40L致敏DCs。实验分4组:K562细胞冻融抗原致敏DCs为实验组A,联合CD40L致敏DCs为实验组B,未致敏DCs为对照组A,单核细胞+异体淋巴细胞组为对照组B,观察CTLs对K562细胞的杀伤效应。结果:培养出具有典型特征的DCs,表达CD40最高达96%、CD86达97%、CD80为77%、CD1a为69%,体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为20∶1时,实验组A对K562细胞的杀伤率为71.3%,实验组B为86.9%,对照组A为37.6%,对照组B为21.1%。实验组均显示高水平杀伤率,与对照组比较差异显著(P<0.05),实验组B加CD40L杀伤率高于实验组A(P<0.05)。结论:K562细胞冻融抗原冲击致敏DCs能有效诱导T细胞特异性抗白血病作用,联合CD40L能增强其CTL的杀伤作用。

CD40、PI3K、p-Akt、VEGF在人胃腺癌中的表达和意义

背景:CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,多种恶性肿瘤中存在CD40表达,其高表达与肿瘤侵袭、转移和预后不良相关。PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生过程中起关键作用。血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤血管生成关系密切。目的:探讨CD40、PI3K、p-Akt、VEGF在人胃腺癌中的表达及其生物学意义。方法:以免疫组化方法检测128例胃腺癌及其相应癌旁组织中的CD40、PI3K、p-Akt、VEGF蛋白表达,分析四种蛋白表达与胃腺癌临床病理特征之间的关系以及四者间的相关性。结果:胃腺癌组织中CD40、PI3K、p-Akt、VEGF蛋白阳性表达率分别为64.8%、84.4%、88.3%和73.4%,而相应癌旁组织中阳性表达率分别为7.0%、30.5%、28.1%和41.4%,两组间四种蛋白表达强度差异均有统计学意义(P<0.001)。CD40表达与胃腺癌远处转移和TNM分期相关,PI3K、p-Akt表达仅与TNM分期相关,VEGF表达与肿瘤分化程度相关。胃腺癌组织中四种蛋白表达两两之间均呈正相关。结论:CD40、PI3K、p-Akt、VEGF在胃腺癌中均呈高表达。CD40可能通过激活PI3K/Akt信号通路上调VEGF表达,从而促进肿瘤血管生成,参与胃腺癌的进展和转移。

CD40、CD40L在人单核细胞和在动脉粥样硬化斑块中共同表达的意义

目的 :探讨CD40、CD40L在人单核细胞及在动脉粥样硬化斑块中共同表达的意义。方法 :CD40及CD40L在单核细胞表面的表达分别采用荧光技术、RT PCR、流式细胞仪和Westernblotting检测。人的动脉粥样硬化斑块中CD40及CD40L的表达采用免疫组织化学方法。结果 :人单核细胞能连续表达CD40及CD40L ,并且细胞因子IL 1、IL 6、TNF和INF γ能明显上调单核细胞表达CD40、CD40L的水平。人动脉粥样硬化斑块中能共同表达CD40及CD40L ,而动脉壁的其它部分不表达。结论 :人单核细胞表面及粥样硬化斑块中能共同高表达CD40和CD40L 。

小鼠CD40分子胞外段基因的克隆、原核表达及活性鉴定

目的构建含小鼠CD40(mCD40)分子胞外段序列的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对mCD40/GST融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定。方法从小鼠DC2.4细胞系中扩增目的基因mCD40并克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达载体pGEX-6P-1-mCD40,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达mCD40/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其抗原活性。结果 PCR扩增产物经测序分析与GenBank公布的小鼠CD40胞外段序列一致;重组表达载体经酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析证实得到了相对分子质量(M r)为45 000的重组蛋白;Western blot法和ELISA检测证实纯化的mCD40/GST蛋白能够与特异性抗体发生反应。结论成功构建了原核表达载体pGEX-6P-1-mCD40,利用原核表达系统实现了mCD40/GST融合蛋白的可溶性表达并证明其具有较高的抗原活性。