木兰花碱调控CD44s/STAT3通路对肺癌细胞迁移、侵袭及干性特征的影响实验研究

目的:探讨木兰花碱(Mag)对肺癌细胞迁移、侵袭、干性特征的影响及其作用机制。方法:使用不同浓度的Mag(0、10、20、40、80、160μmol/L)作用于肺癌细胞A549,检测细胞存活率,根据半抑制浓度(IC 50)值选择10、20、40μmol/L Mag进行后续实验。将肺癌细胞A549随机分为A549组、Mag-L组(10μmol/L Mag培养基培养)、Mag-M组(20μmol/L Mag培养基培养)、Mag-H组(40μmol/L Mag培养基培养)和Mag-H+信号转导及转录激活因子3(STAT3)激活剂Colivelin组(40μmol/L Mag+10μmol/L Colivelin培养基培养)。采用平板克隆形成实验检测各组细胞克隆形成数量。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。采用Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力。采用肿瘤细胞成球实验检测细胞干性。采用Western blot检测各组细胞CD44s/STAT3通路及细胞干性相关蛋白表达。结果:与A549组比较,Mag-L组、Mag-M组、Mag-H组细胞克隆形成数量、迁移及侵袭细胞数、干细胞成球数和细胞中CD44s、STAT3、CD133、八聚体结合转录因子4(OCT4)、SRY-box转录因子2(SOX2)表达水平逐渐降低,而细胞凋亡率逐渐升高(均P<0.05)。在高浓度Mag的基础上加入STAT3激活剂Colivelin逆转了以上指标的变化趋势。结论:Mag能够抑制肺癌细胞迁移、侵袭及干性特征,其机制可能与下调CD44s/STAT3通路有关。

肉桂醛调控CD44s/STAT3信号通路抑制胰腺癌细胞增殖和肿瘤细胞干性

目的探究肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)对胰腺癌PANC-1细胞的增殖、肿瘤细胞干性的影响及其可能的作用机制。方法采用CCK8法检测不同浓度(0、5、15、20、30、50、70、100、150μmol·L^(-1))和不同时间段(24、48、72 h)CA处理对PANC-1细胞存活率的影响;CFSE染色实验检测CA对PANC-1细胞的增殖抑制作用;克隆形成实验检测CA对单个细胞增殖的影响;利用悬浮干细胞成球实验检测CA对成球能力的影响;qRT-PCR和Western blot检测干性相关Nanog、Sox-2及Oct-4基因的表达;流式细胞术分析CA处理前后的CD44^(+)CD24^(+)和ALDH^(+)干细胞亚群比例;Western blot分析CD44s、p-STAT3及STAT3蛋白表达。结果CA可呈浓度和时间依赖性的降低PANC-1细胞的存活率,并抑制肿瘤细胞增殖能力,明显抑制其克隆形成能力;干细胞成球实验结果显示,CA可使细胞成球体积减小,数量变少;CA处理后,细胞的3种干性基因的mRNA和蛋白表达水平均明显降低;CA处理还可减少癌细胞中CD44^(+)CD24^(+)和ALDH^(+)干细胞亚群比例;Western blot结果表明CA可下调CD44s和p-STAT3的表达水平,而对STAT3蛋白表达无影响,加入STAT3激动剂Colivelin TFA可部分回复CA对癌细胞增殖和肿瘤细胞干性的抑制作用。结论CA可显著抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖和肿瘤细胞干性,其机制可能与调控CD44s/STAT3信号通路相关。

JAK2-STAT3/STAT5信号通路与儿童食物过敏CD4^+T淋巴细胞亚群变化的相关性研究

目的:探讨JAK2-STAT3/STAT5信号通路与儿童食物过敏CD4^+T淋巴细胞亚群变化的相关性。方法:收集2015年1月至2017年3月来我院就诊的食物过敏患儿78例,为过敏组;同期收集来我院体检的健康儿童78例,为对照组。并根据儿童年龄将过敏组和对照组分为A、B、C、D四组,其中A组≤1岁,B组1~3岁(不包括1岁),C组3~6岁(不包括3岁),D组6~11岁(不包括6岁)。采用流式细胞仪检测CD4^+T淋巴细胞亚群Th1、Th2、Th17和调节性T淋巴细胞(Treg)百分比,同时采用q PCR检测外周血单核细胞JAK2、STAT3、STAT5的mRNA水平,分析两组儿童上述CD4^+T淋巴细胞亚群和JAK2、STAT3、STAT5表达水平的差异,并进一步分析JAK2-STAT3/STAT5信号通路和CD4^+T淋巴细胞亚群的相关性。结果:对照组A组、B组、C组儿童Th1、Treg淋巴细胞百分比及Th1/Th2、Treg/Th17比值均明显高于过敏组患儿A组、B组、C组,而Th2、Th17淋巴细胞百分比均小于过敏组所对应的同年龄段患儿,随儿童年龄增大,两组间差异均明显减小,但差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组D组儿童和过敏组D组儿童上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。分别针对A、B、C三组患儿JAK2、STAT3、STAT5和CD4^+T淋巴细胞亚群水平进行相关性比较,Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相关性系数均<0(P<0.05),而Th2、Th17的相关性系数均>0(P<0.05),且上述三组的相关系数绝对值逐次减小。上述信号通路分子与CD4^+T淋巴细胞亚群水平在D组均无明显相关性。结论:低龄食物过敏儿童的JAK2-STAT3/STAT5信号通路存在明显活化和CD4^+T淋巴细胞亚群改变现象,JAK2-STAT3/STAT5信号通路可有效调控CD4^+T淋巴细胞亚群的分布,并伴随患儿年龄增大,上述作用相关性减弱并消失。

CD44和CD24在鼻咽癌细胞系HK-1中调控STAT3发生磷酸化的分子机制研究

目的研究CD44和CD24在鼻咽癌细胞系HK-1中调控STAT3发生磷酸化的分子机制。方法采用流式细胞仪对培养的鼻咽癌HK-1高分化NPC细胞进行分选以获得CD44^+/CD24^+HK1细胞及CD44^-/CD24^-HK1细胞,通过Western blot、MTT和肿瘤微球形成等实验,分析鼻咽癌阳性肿瘤细胞中P-STAT3的表达,以及STAT3被抑制剂Stattic沉默后,对CD44^+/CD24^+HK1和CD44^-/CD24^-HK1细胞增值能力和肿瘤微球形成能力的影响。结果鼻咽癌HK-1细胞中可以提取到34.7%的CD44^+/CD24^+HK1细胞和41.5%的CD44^-/CD24^-HK1细胞,CD44^+/CD24^+HK1细胞比CD44^-/CD24^-HK1细胞表达磷酸化STAT3水平高。STAT3的抑制剂Stattic可以抑制CD44^+/CD24^+HK1和CD44^-/CD24^-HK1细胞磷酸化STAT3的表达,MTT实验显示16μmol/L Stattic明显抑制CD44^+/CD24^+HK1和CD44^-/CD24^-HK1细胞增殖,肿瘤微球形成实验表明Stattic可明显抑制CD44^+/CD24^+HK1和CD44^-/CD24^-HK1细胞微球形成能力,即STAT3在CD44^+/CD24^+HK1细胞增殖和鼻咽癌进程中发挥重要的作用。结论 CD44和CD24在鼻咽癌侧群细胞HK-1细胞中,CD44^+/CD24^+阳性细胞通过诱导STAT3发生磷酸化来促进鼻咽癌发展,为鼻咽癌肿瘤干细胞的靶向治疗提供了新的靶点,临床治疗可靶向抑制STAT3的表达,从而抑制CD44^+/CD24^+HK1细胞增殖和肿瘤微球的形成,最终达到降低鼻咽癌的发生率。

寻常型银屑病血热证患者IL-6R/STAT3通路及其下游基因的表达

目的:探讨IL-6R/STAT3通路及其下游基因在寻常型银屑病血热证中的表达及意义。方法:采用RTPCR方法检测寻常型银屑病血热证患者及正常对照组外周血白细胞IL-6R、JAK2、STAT3、CD80、CCL5的表达。结果:上述检测指标相对表达量在疾病组中分别为0.333±0.079、0.206±0.040、0.296±0.048、0.219±0.053、0.588±0.114,与正常对照组表达量0.205±0.060、0.192±0.038、0.194±0.057、0.003±0.001、0.372±0.107比较,其中IL-6R、STAT3、CD80、CCL5表达水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),而JAK2表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:IL-6R/STAT3通路及其下游CD80、CCL5均可能参与了寻常型银屑病血热证的发病过程;IL-6R可能不是通过JAK2而是通过JAK家族中的其他途径或旁路来影响STAT3的表达。

LY294002通过PI3K/Akt/mTOR对CD133+CD44+结直肠癌干细胞自我更新、增殖能力的影响

目的:探讨LY294002对CD133+CD44+结直肠癌干细胞自我更新、增殖能力的影响及其机制。方法:通过流式细胞术从人结直肠癌HCT116细胞中分选CD133+CD44+的肿瘤干细胞(CSCs),不同浓度(10、20、30μmol/L)LY294002作用CSCs,对照组不使用药物。成球实验及有限浓度稀释法检测细胞自我更新能力,细胞活性计数法及平板克隆实验检测增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR及流式细胞术检测PI3K/Akt/mTOR信号通路基因Akt、磷酸化Akt、诱骗受体3(DcR3)、B淋巴细胞瘤-2(Bc--2)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达变化。结果:与对照组相比,30μmol/L LY294002作用实验组成球能力明显削弱(P<0.01),CSCs比例明显下降(P<0.05),增殖能力明显削弱(P<0.01),G0G1期细胞周期受到阻滞(P<0.01);磷酸化Akt表达降低(P<0.01),DcR3、Bcl-2、mTOR及Cyclin D1表达量下调(P<0.01)。结论:LY294002可能通过PI3K/Akt/mTOR通路导致结直肠癌CSCs周期阻滞、抑制其自我更新、增殖能力。

PI3K/AKT信号转导通路在肝癌细胞生长和黏附中的作用

目的:探讨PI3K/AKT(磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B)信号转导通路在人肝癌细胞株SMMC-7221生长和黏附中的作用机制.方法:应用LY294002作用于SMMC-7221细胞,并设对照组和实验组(LY294002:5、10、20、40μmol/L),MTT法检测LY294002作用24、48、72、96h后,对SMMC-7221细胞增殖的影响;采用肿瘤细胞-基质黏附实验检测对照组和干预组SMMC-7221黏附能力的变化;流式细胞仪检测肝癌细胞黏附分子CD44s表达情况;细胞免疫化学S-P法检测SMMC-7221细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和CD44V6蛋白表达.结果:LY294002对SMMC-7221细胞的增殖有抑制作用,呈剂量和时间依赖性;5、10mol/L的LY294002作用于肝癌细胞后与对照组相比CD44s,VEGF,CD44V6蛋白表达下降(CD44s:42.84%±6.35%,20.21%±4.5%vs89.23%±3.91%,P<0.01;VEGF:103.11±18.60,68.99±15.99vs137.84±22.50,P<0.01;CD44V6:47.33±6.15,33.09±5.23vs61.36±7.39,P<0.01);5、10μmol/L的LY294002干预后与对照组相比SMMC-7221黏附能力下降(0.498±0.024,0.407±0.029vs0.616±0.080,P<0.01).结论:阻断PI3K/AKT信号传导通路,肝癌细胞生长受到抑制、黏附能力下降.LY294002抑制肝癌细胞黏附力的作用机制与通过降低CD44V6、CD44s和VEGF水平有关.

黏附分子CD44的表达与大肠癌生物学特性间的关系

目的:探讨CD44s、CD44v6、CD44v3的表达水平与大肠癌生物学特性之间的关系及临床意义。方法:应用Envision TM免疫组化法,检测57例大肠癌组织标本和20例癌旁正常组织中CD44s、CD44v6、CD44v3的表达水平。结果:57例结直肠癌的组织标本中CD44s、CD44v6、CD44v3的阳性表达率为分别66.67%、63.16%、70.18%,而在20例正常组织中基本不表达,二者间具有统计学差异(P<0.01)。CD44s、CD44v6、CD44v3阳性表达与临床分期、肿瘤细胞分化程度显著性相关(P<0.05)。CD44v6、CD44v3阳性表达还与淋巴结转移显著相关。大肠癌组织中CD44s、CD44v6、CD44v3阳性,阴性表达的患者5年生存率分别为55.26%,78.95%;52.79%,80.95%;52.50%,88.24%,CD44s二者间差异无统计学意义(P>0.05);CD44v6、CD44v3二者间差异具有统计学意义(P<0.01)。生存率分析显示CD44s、CD44v6、CD44v3均是对生存有影响的因子。结论:黏附分子CD44s、CD44v6、CD44v3可能参与了大肠癌的发生与转移,检测其表达水平有助于预后判断。

温胆汤对肥胖痰湿证大鼠相关炎症因子及JAK2/STAT3通路关键分子STAT3表达的影响

目的:观察温胆汤对肥胖痰湿证大鼠外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素(IL)-6,IL^(-1)7,IL-22等相关炎症因子以及下丘脑组织Janus激酶2/信号传导子及转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路关键分子STAT3 mRNA和蛋白表达的影响,探讨温胆汤干预肥胖痰湿证的内在作用机制。方法:将100只大鼠随机分成2组(空白组30只和造模组70只),空白组采用基础饲料喂养,造模组采用高脂饲料喂养,共6周,制作肥胖痰湿证动物模型。造模成功后,视体质量情况,按顺序淘汰体质量过轻者,遴选出16只肥胖大鼠,并随机分成模型组和温胆汤干预组,每组8只;另在空白组大鼠中随机选取8只设为正常组。温胆汤干预组按剂量15 g·kg^(-1)(以生药量计算)进行灌胃,模型组和正常组均给予等量蒸馏水进行灌胃,每天1次,共6周。麻醉处理前12 h禁食不禁水,麻醉后进行样本取材,检测并计算大鼠体质量,Lee's指数和肥胖率,根据试剂盒要求采用全自动生化分析仪检测大鼠总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠外周血血清中相关细胞因子TNF-α,IL^(-1)7,IL-22,IL-6的表达;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术检测大鼠下丘脑组织中STAT3 mRNA的表达;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定大鼠下丘脑组织中STAT3蛋白的表达。结果:高脂饲料喂养成功复制了肥胖大鼠模型,造模组大鼠肥胖率> 20%,且与空白组比较,造模组体质量和Lee's指数显著升高(P <0. 05,P <0. 01)。与正常组比较,模型组大鼠体质量显著升高(P <0. 01),血脂水平显著改变(P <0. 01),相关炎性因子(TNF-α,IL-6,IL^(-1)7和IL-22)的水平显著升高(P <0. 01),下丘脑组织中STAT3 mRNA和蛋白的表达显著升高(P <0. 01)。与模型组比较,温胆汤干预组大鼠体质量和Lee's指数显著下降(P <0. 05,P <0. 01),血脂水平显著变化(P <0. 01),相关炎性因子(TNF-α,IL-6,IL^(-1)7和IL-22)的水平显著下降(P <0. 01),下丘脑组织中STAT3 mRNA和蛋白的表达显著下降(P <0. 01)。结论:温胆汤可改善肥胖大鼠痰湿病理状态,其作用机制可能与调节JAK2/STAT3信号通路进而改善机体的慢性炎症状态有关,为温胆汤干预肥胖痰湿证提供了实验依据。

STAT3信号传导通路对皮肤恶性黑色素瘤细胞G1-S期的调控

皮肤恶性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）是起源于皮肤黑色素细胞的常见体表恶性肿瘤，是最致命的皮肤癌。近年来其发生率在中国乃至世界范围内稳定增长。信号转导子和转录激活子3（signal transducers and activators of transcription, STAT3）为目前的研究热点，其过度激活与众多肿瘤的发生、发展及转移息息相关。

基于ARM7实现GPS信号叠加视频输出设计

提出一种采用ARM7TDMI内核的S3C44B0微处理器实现GPS信号叠加视频输出设计方案,并给出了S3C44B0、GPS、LM1881和Upd6453的主要技术指标。该系统应用于无人机图传系统中,取得良好的效果,满足设计的要求。

SOX2基因对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响研究

目的探讨SOX2基因对人骨关节炎(OA)软骨细胞凋亡的影响及机制。方法以正常软骨组织作为对照,通过Western blotting检测OA软骨组织SOX2蛋白表达。从人OA中分离软骨细胞,参照Lipofectamine^(TM)2000说明将重组体pcDNA3.1-SOX2及空载体pcDNA3.1转染软骨细胞,并设置空白对照组。AG490作为JAK2/STAT3信号通路抑制剂,各组细胞处理48 h,通过流式细胞术、ROS试剂盒分别检测各组细胞凋亡率及ROS水平。Western blotting检测JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白相对表达量。结果人OA软骨组织SOX2表达明显低于在正常软骨组织表达(0.065±0.009 vs 0.313±0.028,P<0.05)。转染pcDNA3.1-SOX2的OA软骨细胞SOX2表达明显高于空白组(0.556±0.048 vs 0.122±0.013,P<0.05)。pcDNA3.1-SOX2可明显降低OA软骨细胞凋亡率(3.11±0.42 vs 8.54±0.68)及ROS水平(23.46±2.15 vs 52.67±4.41),上调p-JAK2(0.142±0.013 vs 0.065±0.009)和p-STAT3表达(0.218±0.020 vs 0.126±0.015)(P<0.05),AG490(15.23±1.13 vs 8.15±0.62)可诱导OA软骨细胞凋亡,而pcDNA3.1-SOX2可减弱AG490对OA软骨细胞凋亡促进作用(P<0.05)。结论SOX2可抑制OA软骨细胞凋亡,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路有关。

耳、鼻、咽、喉

广东鼻咽癌高危家族成员发病危险性的流行病学研究//EB病毒潜伏膜蛋白1介导鼻咽癌细胞中转录因子Ets-1表达的实验研究//EGCG干预LMP1激活的AP-1信号转导通路//鼻咽癌的p73蛋白表达与细胞凋亡关系//鼻咽癌患者血清VEGF、CD44s。

S100A6通过巨噬细胞促结直肠癌细胞增殖的作用及机制

目的:探讨微环境中钙周期素S100A6是否通过影响巨噬细胞(macrophages,M_φ)进而促进结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞的增殖及其机制。方法:制备(原核表达)并鉴定带GST(glutathione S-transferase,谷胱甘肽S-转移酶)标签的人重组S100A6蛋白(recombinant GSTh S100A6,r S100A6)和对照蛋白GST;采用台盼兰计数、CCK8和结晶紫染色检测CRC细胞系HCT116的增殖能力;用定量实时聚合酶链反应检测M_φ中IL-6 mRNA水平;用Western blot检测M_φ中IL-6的蛋白水平、HCT116细胞中JAK2和STAT3及其磷酸化水平。结果:(1)成功制备r S100A6和GST蛋白。(2)与经r S100A6处理的M_φ(即A6-M_φ)共培养后,HCT116细胞的增殖能力增强(P <0. 05);同时,HCT116细胞中的JAK2和STAT3水平无明显变化,但其磷酸化水平提高(P <0. 05)。(3) A6-M_φ中,IL-6的mRNA和蛋白水平均升高(P <0. 05)。(4)在HCT116与A6-M_φ的共培养体系中加入IL-6R封闭肽后,A6-M_φ促HCT116细胞的活力和增殖能力的作用被部分逆转(P <0. 05)。结论:微环境中的S100A6可通过上调巨噬细胞中IL-6的表达、进而激活HCT116细胞中IL-6/JAK2/STAT3信号通路来促进CRC细胞的增殖。

S100A6通过招募和活化巨噬细胞促进血管形成

目的:探讨S100A6经由巨噬细胞介导的促血管生成作用及机制。方法:(1)用重组蛋白GST-hS100A6处理巨噬细胞后:①收集上清制备条件培养基(简称A6-Mφ-CM),并用之重悬人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用体外血管形成试验检测各处理因素对血管形成的影响;②分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测巨噬细胞的M2型标志物CD163及促血管形成因子CCL2、IL-6、VEGFA的mRNA和蛋白质水平,以及JAK2和STAT3的蛋白质及其磷酸化水平;③用Transwell迁移试验检测巨噬细胞迁移能力的变化。(2)使用JAK2抑制剂(XL019)预处理巨噬细胞后再加GST-hS100A6处理,检测S100A6促巨噬细胞迁移作用的变化。以重组蛋白GST为实验对照。结果:(1)A6-Mφ-CM组的血管分支数和血管分支长度既明显高于GST-Mφ-CM组(P值均小于0.05),也明显高于GST-hS100A6直接处理的HUVEC组(P<0.001,P<0.01),提示S100A6处理后的巨噬细胞具有促进血管形成的作用;(2)GST-hS100A6处理后的巨噬细胞中,CD163、CCL2、IL-6、VEGFA的mRNA和蛋白质水平明显高于GST组(P值均小于0.05),提示S100A6诱导巨噬细胞向促血管表型(pro-angiogenic phenotype)转化;(3)GST-hS100A6处理后,巨噬细胞的迁移数是GST组的1.4倍(P<0.01),提示S100A6具有招募巨噬细胞的作用;(4)GST-hS100A6处理组巨噬细胞的JAK2和STAT3的蛋白质及其磷酸化水平都明显高于GST组(P值均小于0.05),而JAK2抑制剂XL019可部分抑制S100A6促进巨噬细胞迁移的作用(P<0.01),提示S100A6促进巨噬细胞迁移作用机制涉及JAK2/STAT3信号通路的激活。结论:微环境中的S100A6可通过招募巨噬细胞并进一步诱导其向促血管表型转化,进而促进新生血管形成;其招募巨噬细胞的机制涉及JAK2/STAT3信号通路的激活。