CD47分子胞外区蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定抗人CD47分子胞外区蛋白单克隆抗体。方法聚合酶链反应扩增人CD47胞外区基因序列,重组至原核表达载体pET-32a(+)中,利用大肠埃希菌表达系统表达CD47胞外区蛋白。用纯化的CD47胞外区蛋白免疫小鼠,采用常规方法进行细胞融合,经克隆化培养后,筛选能够特异性分泌鼠抗人CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附法、Western blot和流式技术检测抗体效价及特异性。结果成功构建人CD47原核表达载体,在BL21(DE3)中获得表达,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot鉴定后,采用层析柱法获得纯化的CD47胞外区蛋白。以纯化蛋白为免疫原,成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。结论成功制备了针对CD47分子胞外区蛋白的高亲和力单克隆抗体,为进一步研究CD47的生物学功能奠定了基础。

慢病毒介导的siRNA靶向CD47基因对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡的影响

目的探究慢病毒载体介导siRNA抑制CD47基因表达后对人喉癌细胞株Hep-2体外增殖凋亡的影响。方法构建慢病毒载体,将靶向CD47基因的siRNA慢病毒转染至Hep-2细胞;用荧光显微镜行细胞形态学变化观察;RT-PCR检测细胞CD47 mRNA表达的变化;Western blotting检测CD47蛋白表达的变化情况;MTT法检测细胞的增殖凋亡情况。结果 CD47-siRNA慢病毒转染Hep-2细胞后,形态学观察显示CD47-siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,细胞变形明显,体积变小,可见细胞坏死及凋亡。RT-PCR和Western blotting检测显示,CD47的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P〈0.05）,使CD47 mRNA表达减少76%~82%,CD47蛋白表达减少77%;慢病毒转染细胞在48h后MTT检测细胞凋亡率明显提高（P〈0.01）。结论慢病毒介导的siRNA干扰CD47基因表达后,明显抑制了喉癌Hep-2细胞CD47的表达并且诱导了Hep-2凋亡。

阵发性睡眠性血红蛋白尿患者外周血细胞CD47的表达

目的:通过研究阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者外周血细胞CD47的表达,探讨CD47在PNH发病机制中的作用。方法:选取PNH患者8例,正常对照组15例,以逆转录-聚合酶链反应异源双链分析银染法进行PIG-A基因检测,流式细胞术检测外周血细胞表面CD47、CD59的表达。结果:6例PNH患者PIG A基因第2外显子有碱基变异,其余2例未发现异常;PNH患者外周血红细胞、粒细胞CD47表达阳性率及平均荧光强度比正常对照组均减低(P<0．05)。结论:PNH患者外周血细胞表面CD47表达减少,CD47的表达与PNH发病机制可能有关。

CD47重组质粒及其过表达重组大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定

目的:构建CD47重组质粒并将其转染至大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),建立稳定过表达CD47的BMMSCs,为研究干细胞治疗中逃避免疫监视的有关机制提供实验模型。方法:构建过表达CD47基因的质粒载体,转染至分离培养的大鼠BMMSCs,RT-PCR、Western blot分别检测干细胞CD47 mRNA、蛋白水平的表达,并完成功能检测。结果:成功构建了pYr-ads-4-ratCD47质粒,经酶切、测序结果表明pYr-ads-4-ratCD47重组质粒构建成功;RT-PCR、Western blot显示实验组转染至大鼠BMMSCs后CD47的mRNA和蛋白水平表达明显增高(P<0.05);功能检测提示过表达CD47分子的BMMSCs成功逃避巨噬细胞吞噬。结论:经质粒介导可成功将大鼠CD47目的基因片段转染至大鼠BMMSCs,并能够在体外有效的过表达。

CD_(47)与临床疾病相关研究现状及展望

CD47是细胞表面的重要靶点,是现今临床基因靶向治疗研究的焦点之一,本文对CD47及其相关表达进行了简述,并总结了CD47与炎性疾病、骨性疾病及血液性疾病的相关研究现状,旨在帮助临床医务人员对CD47有进一步的了解,为临床疾病的治疗提供一定的依据与方向。

CD47基因对食道癌细胞增殖的影响

本研究将CD47-si RNA转染至食道癌细胞,采用蛋白免疫印迹检测食道癌细胞中CD47蛋白的表达,MTT法检测CD47-siRNA转染组和空质粒转染组(对照组)食道癌细胞增殖状态,蛋白免疫印迹检测CD47-siRNA转染组和空质粒转染组(对照组)食道癌细胞中PCNA蛋白表达,DCFDA染色流式细胞仪检测食道癌细胞CD47-siRNA转染组和空质粒转染组(对照组)中ROS水平,以探究CD47基因对食道癌发生发展的影响。研究结果表明,CD47-si RNA转染组食道癌细胞中CD47蛋白明显低于对照组;CD47-siRNA转染组食道癌细胞增殖率显著低于对照组(p<0.05);CD47-siRNA转染组细胞增殖相关蛋白PCNA低于对照组(p<0.01);CD47-siRNA转染组食道癌细胞中ROS水平明显高于对照组(p<0.05)。本研究初步认为:CD47-siRNA可降低食道癌细胞中CD47蛋白表达,抑制食道癌细胞的增殖并增加食道癌细胞中ROS水平。