小鼠抗人CD52功能性抗体的制备与鉴定

目的鼠抗人CD52抗血清的制备与功能鉴定。方法由人Hut-78细胞提取细胞总RNA,运用RT-PCR方法扩增CD52基因,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),用脂质体转染法转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、FACS、免疫组织化学技术检测目的蛋白的表达。用CD52合成肽免疫小鼠,通过间接ELISA和流式细胞术分析抗血清,用MTS实验鉴定抗体对白血病LCL细胞系的增殖抑制作用。结果建立了稳定转染的CHO细胞系。鉴定出有高效价抗体存在。MTS实验检测免疫血清有抑制LCL细胞生长作用。结论功能性抗体制备成功并建立了稳定转染CD52的CHO细胞系。

抗CD52单克隆抗体ADCC转基因测活方法的建立

目的 建立转基因细胞法测定抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法 ①以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat-hFcγRⅢa/FcεRIγ-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright-GloTM luciferase Assay System)建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法;②对靶细胞、量效范围、效靶比及诱导时间进行优化并进行方法学验证;③研究建立的方法应用于对不同抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测。结果 建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法,抗CD52单抗在该方法中存在量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D;经优化后确定抗体量效范围为起始质量浓度360μg/mL,4倍系列稀释9个稀释度;效靶比为3∶1,诱导时间为6.0h;该方法具有良好的专属性;4个不同稀释组回收率样品经3次测定,相对效价分别为(45.58±4.67)%、(71.61±9.45)%、(122.92±7.92)%和(149.94±14.58)%;对应的回收率分别为(91.16±9.34)%、(95.49±12.60)%、(98.34±6.34)%和(99.96±9.72)%,上述结果的变异系数(coefficientofvariation,CV)均小于15%;且该方法也适用于不同抗CD52单抗的ADCC效应评价。结论 利用转基因细胞法成功建立了抗CD52单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD52单抗的ADCC生物学活性。

人源化CD52单克隆抗体诱导食蟹猴动物模型的建立

目的:建立人源化CD52单克隆抗体诱导食蟹猴的动物模型。方法:使用流式细胞仪筛选出红细胞表面不表达CD52抗原的食蟹猴,并观察给药后不同时间血中淋巴细胞数量变化情况。结果:食蟹猴血中淋巴细胞呈现出快速被清除及恢复的过程。CD20+B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞分别在给药后213、5和56 d恢复至给药前水平。结论:食蟹猴外周血中淋巴细胞清除效果略低于临床病人,恢复速度较快。本实验模型可用于临床人源化CD52单克隆抗体器官移植前的实验研究。

重组抗CD52人源化单克隆抗体ELISA检测方法的建立

目的：建立一种灵敏、特异、快速的ELISA方法,用于检测食蟹猴血清中重组抗CD52单克隆抗体的含量。方法：采用双抗夹心ELISA法对重组抗CD52单克隆抗体进行定量。以猴血清吸附的羊抗人Ig G作为包被抗体,稀释的猴血清吸附的羊抗人Ig G-HRP（二抗）作为检测抗体,加入底物显色剂后在酶标仪上读取D450nm值。结果：建立并确证了检测重组抗CD52单克隆抗体的ELISA方法,方法的线性范围为7.81~500 ng/m L,定量下限为7.81 ng/m L,板内及板间精密度和准确度均在±15%以内,室温、冻融、稀释效应稳定性良好。结论：方法学验证表明ELISA法测定食蟹猴血清中重组抗CD52单克隆抗体浓度的特异性、精密度和准确度均满足新生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于重组抗CD52单克隆抗体的检测。

抗CD52单克隆抗体中残留蛋白AELISA定量检测方法的验证

目的验证抗CD52单克隆抗体(单抗)中残留蛋白A(Protein A,Pro A)ELISA定量检测方法。方法使用Cygnus公司的Mix-N-Go Protein A检测试剂盒,对抗CD52单抗中的Pro A残留量进行检测,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性及定量限。结果亲和填料(Mab Select SuRe)稀释1 000倍后仍检测到含有Pro A 1.9 ng/m L;制剂及抗CD52单抗细胞发酵液中未检出Pro A;3种不同Pro A加标质量浓度6次试验的加标回收率均在80%~120%之间;3种不同Pro A加标质量浓度重复性检测结果及中间精密度检测结果 RSD均<20%;分别对3次Pro A残余检测结果绘制的四参数标准曲线,R2均>0.990;定量限为0.16 ng/m L。结论经验证,抗CD52单抗中Pro A残留量的ELISA定量检测方法专属性好,准确度、精密度高且线性良好。

CD52单抗通过清除活化T细胞对IL-10基因敲除小鼠结肠炎的干预作用

目的:观察CD52单抗对IL-10基因敲除小鼠结肠炎的干预作用并探究其干预作用的可能机制。方法:给予CD52单抗治疗后,计算疾病活动度指数,检测结肠病理学评分,外周血、脾脏及结肠固有层单个核细胞中T淋巴细胞的清除情况,结肠组织炎性因子水平及相关细胞因子的m RNA转录水平的变化。结果:CD52单抗能有效降低疾病活动度评分、结肠病理学评分,能显著地清除模型小鼠外周血、脾脏及结肠固有层单个核细胞中CD3+T细胞,明显降低结肠组织中IFN-γ、IL-17的表达水平,同时增加了IL-5和IL-13的表达,并相应下调TNF-α、IFN-γ、IL-17和IL-6及炎症调控因子IL-12和IL-23的m RNA表达水平。结论:抗CD52单抗能有效地治疗IL-10基因敲除小鼠的结肠炎,其干预效果与活化T细胞的直接清除相关,此外,其对IL-12/23通路的下调及Th2反应的诱导作用亦可能与干预作用相关。

CD52在肿瘤研究中的相关进展

CD52分子是由12个氨基酸组成的小分子糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定糖蛋白,在N末端第3位天冬酰胺处高度糖基化,与细胞膜上的GPI在C末端处相连接。CD52分子主要在淋巴细胞、单核细胞等血细胞及恶性淋巴瘤细胞广泛表达,在雄性生殖系统的某些细胞表面也可表达,在B细胞与T细胞中高度表达。早期关于癌症界CD52的研究重点集中在B淋巴细胞肿瘤,近年来越来越多的研究表明CD52与实体性肿瘤及一些疾病也有着重要关系。该文就CD52分子结构、基因结构及其细胞组织分布情况,与其在一些疾病和几种常见肿瘤的研究进展等方面做一综述。

基于报告基因的抗CD52单克隆抗体ADCP生物学活性测定方法的建立

目的建立基于报告基因的抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)生物学活性检测方法。方法(1)以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ转基因细胞系作为效应细胞,通过荧光素酶检测系统(BrightGlo^(TM) luciferase assay system)建立抗CD52单抗的ADCP生物学活性检测方法。(2)对单抗量效范围、效靶比及诱导时间进行优化和方法学验证。(3)将本研究建立的方法应用于对不同抗CD52单抗的ADCP生物学活性检测。结果建立抗CD52单抗的ADCP生物学活性检测方法,抗CD52单抗在该方法中存在量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)^(B)]+D;本方法经优化后确定抗体量效范围为起始工作质量浓度720μg/mL,1∶4倍系列稀释10个稀释度;效靶比为1∶2,诱导时间为20 h;本方法经方法学验证,具有良好的专属性;5个不同稀释组回收率样品经3次测定,相对效价分别为(52.81±5.61)%、(83.66±8.48)%、(100.45±2.65)%、(140.89±8.26)%和(155.10±13.23)%;对应的回收率分别为(105.61±11.22)%、(111.54±11.31)%、(100.45±2.65)%、(112.71±6.61)%和(103.40±8.82)%,上述结果的变异系数(coefficient of variation,CV)均<11%;且该方法也适用于不同抗CD52单抗的ADCP效应评价。结论利用转基因细胞法成功建立了抗CD52单抗ADCP生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD52单抗的ADCP生物学活性。

3种不同Protein A亲和层析填料纯化抗CD52单克隆抗体的比较

目的比较3种Protein A亲和层析填料MabSelect SuRe、Protein A Diamond及UniMab 50纯化抗CD52单克隆抗体的载量及纯化效果。方法将浓度为1.24 mg/mL的抗CD52单克隆抗体分别流经3种Protein A亲和层析填料,确保保留时间一致,检测流穿液的抗体浓度,以流穿液中抗体浓度达10%上样浓度时的上样量确定填料的最大动态载量。3种填料均按80%最大载量上样,纯化3批抗CD52单克隆抗体培养上清样品,比较洗脱体积、抗体回收率及洗脱收集液中抗体浓度、抗体纯度、电荷异质性、宿主蛋白残余量、宿主DNA残余量、填料配基Protein A脱落量。结果填料MabSelect SuRe与Protein A Diamond在载量、宿主蛋白残余量、填料配基Protein A脱落量方面接近;在抗体纯度、电荷异质性、宿主DNA残余量方面,3种填料表现相当;在抗体回收率、洗脱体积及抗体浓度方面,UniMab 50表现最佳。结论 3种填料亲和纯化抗CD52单克隆抗体的效果各有优劣,但均可满足该纯化步骤的要求,可根据实际工艺状况及质控要求进行选择。

CD52单克隆抗体通过抑制Th1/17介导的炎症及诱导调节性T细胞反应对克罗恩病模型小鼠结肠炎的治疗作用

拟观察CD52单克隆抗体对IL-10基因敲除克罗恩病模型小鼠结肠炎的治疗作用并揭示其可能的机制。结果显示,CD52单克隆抗体能有效治疗模型小鼠结肠炎症,降低Th1/17相关炎性因子的表达,同时能增加结肠固有层调节性T细胞的比例及功能。提示其治疗作用的机制可能与抑制Th1/17介导的炎症及诱导调节性T细胞反应相关。

重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺的优化

目的优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺。方法采用试验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺,试验因子为中间清洗液Na Cl浓度(130~870 mmol/L)和洗脱液p H(3.50~4.20),试验响应变量为纯化后样品收率、纯度、残余宿主蛋白含量、外源DNA含量及蛋白A含量,通过DOE构建模型,预测中间清洗液Na Cl浓度和洗脱液p H范围。同时采用DOE方法验证预测工艺参数的稳定性。结果确定中间清洗液Na Cl浓度为400~700 mmol/L,洗脱液p H为3.55~3.75。试验因子在该参数范围内变动时,样品收率均大于80%,纯度均大于97%,外源DNA浓度均低于260 pg/mg,宿主蛋白含量均低于2 300 ng/mg,蛋白A含量均低于6.5 ng/mg。结论成功优化了重组抗CD52单克隆抗体的亲和纯化工艺,且具有较好的稳定性。

重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性检测方法的建立及验证

目的建立重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性的检测方法,并进行验证。方法测定3种人淋巴瘤细胞(MC/CAR、HUT78、RAMOS)CD52抗原的表达率,选择CD52表达率最高的作为靶细胞。以系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体的参比品和供试品作用表达CD52抗原的人淋巴瘤细胞,FITC标记的兔抗人Ig G结合人淋巴瘤细胞上的重组人源化抗CD52单克隆抗体,流式细胞分析仪测定几何荧光均数。通过四参数方程拟合,计算参比品和供试品的半数有效浓度(EC50)及相对结合活性。并对该方法的专属性、准确性、精密性、线性范围和耐用性进行验证。结果淋巴瘤MC/CAR细胞CD52抗原表达率最高,确定该细胞为靶细胞。CD52抗原与无关抗体不存在特异性结合;重复3次测定不同理论相对结合活性人源化抗CD52单克隆抗体参比品的回收率在97.4%~111.9%之间,相对结合活性及回收率的RSD值均在10%以内;同一实验人员于同一天6次重复检测重组人源化抗CD52单克隆抗体相对结合活性在86.93%~114.42%之间,RSD值在10%以内,3 d内不同实验员分别检测5个效价样品的相对结合活性的RSD在20%以内;在重组人源化抗CD52单克隆抗体理论效价50%~150%范围内,与相对结合活性呈良好的线性,线性回归方程为y=1.045 2 x-1.082,R2为0.992 1;MC/CAR细胞在第28代时仍适用于抗CD52抗体相对结合活性的测定。结论该方法具有良好的特异性、准确性、精密性、线性和耐用性,且操作简便,可用于重组抗CD52抗体抗原结合活性的常规检测。

重组人源化抗CD52单克隆抗体稳定性研究

目的考察人源化抗CD52单克隆抗体的稳定性。方法通过2~8℃长期稳定性试验、(25±2)℃加速稳定性试验以及(42±2)℃强制加速试验考察3批人源化抗CD52单克隆抗体在不同条件下的稳定性,对产品的蛋白质质量浓度、纯度、相对结合活性、电荷异质性进行检测。结果样品蛋白质质量浓度和纯度不随时间改变,电荷异质性和相对结合活性随时间增加而降低。3批原液在2~8℃存储可以在36个月内均保持合格;25℃可以在3个月内保持合格;42℃可以在7 d内保持合格。结论人源化抗CD52单克隆抗体稳定性良好,同时可以短期耐受42℃条件。

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60~300μg的抗体含量范围内线性良好,r~2≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%~106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%~20%,半乳糖相对含量≥25%。结论 方法学验证结果显示,所有考察项目中该分析方法均满足要求,可用于重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析。本实验建立的相关质量标准适用于重组人源化抗CD52单克隆抗体生产过程中N-糖糖型的质量控制,也可作为该产品未来商业化生产时放行标准的制定依据。

免疫诱导治疗可改善器官移植后长期预后:美国器官分配联合网络注册数据分析

免疫诱导治疗可降低器官移植后急性排斥反应的发生率,但其对移植物和受者长期存活的影响尚未明确。

多发性硬化症治疗药Alemtuzumab的Ⅲ期临床研究又获新数据

本刊曾在2011年第11期上刊登过一则有关多发性硬化症（MS）治疗药——抗CD52单抗alemtu—zumab（专利名：Lemtrada^TM）的Ⅲ期临床研究获得阳性结果的报道。Genzyme公司近日在第64届美国神经病学学会（AAN）年会上公布了本品在该项名为CARE—MSII的Ⅲ期临床研究中的最新数据。