糖基化CD59在妊娠期糖尿病精准诊断中的研究进展

近年来,妊娠期糖尿病(GDM)患病率显著升高,引发产妇及其子代多种不良结局,而早期诊断和良好控制血糖可显著改善妊娠结局。目前,GDM诊断主要依据口服葡萄糖耐量试验(OGTT),但临床应用时存在诸多不足。新型生物学标志物糖基化CD59是一种补体调节蛋白的糖基化产物,可在体液中稳定存在,与血糖水平呈线性相关,具有测试简便、可重复性佳等优点,且已开发出可稳定使用的试剂盒,在GDM的早期诊断、标准诊断和妊娠结局预测等方面均显示出良好的价值。

血型CD59基因在胰腺癌中的表达及临床意义

目的运用生物信息学技术分析CD59血型基因在胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)中的表达水平以及临床意义。方法通过GEPIA、UALCAN和HPA数据库分析PAAD中CD59的mRNA和蛋白表达水平。通过TIMER数据库分析CD 59在PAAD中与免疫细胞浸润的相关性。通过UALCAN数据库分析CD59参与信号通路影响PAAD的进展。通过STRING数据库分析CD59表达与上下游蛋白的相互作用。基于单因素Cox,多因素Cox回归结果分析CD59血型与PAAD预后相关。结果与癌旁组织相比,CD59在PAAD中的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),与CD59低表达PAAD患者相比,高表达CD59的患者预后差。CD59在PAAD中表达水平与CD8+T细胞,巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞呈正相关(P<0.05)。基于单因素Cox和多因素Cox回归分析高表达CD 59是PAAD预后危险因素。KEGG富集分析占主导地位的是补体和凝血级联通路,GO富集分析占主导地位的是蛋白质加工的调控信号通路。结论CD59血型基因在PAAD中呈现高表达,与PAAD的发生、发展和预后不良相关,有望作为PAAD诊断、预后判断和治疗靶点。

外周血CD59,LGR5和CK7水平表达对宫颈癌前病变进展风险的预测价值研究

目的 探讨联合检测外周血CD59,血富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-repeat-rich G-protein coupled receptor 5,LGR5)和细胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)对宫颈癌前病变进展风险的预测价值。方法 回顾性分析2019年1月~2022年1月西安市第三医院收治的342例宫颈癌前病变患者的临床资料,根据病情进展情况分为宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias, CIN)Ⅰ组(n=89),CINⅡ组(n=128),CINⅢ组(n=65)和宫颈癌组(n=60)。统计四组一般资料,CD59,LGR5和CK7,Logistic回归方程分析癌前病变进展至宫颈癌影响因素,绘制决策分析(decision curve analysis,DCA)曲线分析CD59,LGR5和CK7联合临床获益度,绘制临床影响曲线(clinical impact curve,CIC)分析在各个阈概率下,CD59,LGR5和CK7联合预测价值与实际情况符合度。结果 宫颈癌组、CINⅢ组、CINⅡ组和CINⅠ组患者HPV感染率(50.00%,7.70%,1.56%,0.00%)及外周血CD59蛋白(55.35%±6.38%,46.17%±5.12%,42.24%±4.13%,38.35%±4.02%),LGR5基因(0.91±0.25,0.38±0.08,0.25±0.06,0.15±0.04),CK7基因(10.12±3.04,7.96±1.55,7.12±1.48,6.50±1.36)表达水平比较,宫颈癌组> CINⅢ组> CINⅡ组>CINⅠ组,差异具有统计学意义(χ^(2)=118.290,F=165.265,567.350,51.982,均P <0.05);Logistic回归显示,CD59(OR:3.483,95%CI:1.614~7.518),LGR5(OR:5.241,95%CI:2.689~10.214),CK7(OR:4.078,95%CI:1.461~11.742)水平是癌前病变患者进展至宫颈癌的高危因素(P <0.05);DCA曲线显示,在0.1~0.45范围内,LGR5,CK7和CD59联合应用具有更高临床获益度;CIC曲线显示,横轴从0.4后,LGR5,CK7和CD59联合预测价值与实际情况具有较高的符合率。结论 LGR5,CK7和CD59是影响癌前病变进展至宫颈癌高危因素,三者联合或可成为预测患者临床获益有效方案,有利于减少宫颈癌发生,增加患者净获益。

急性加重期特发性间质性肺炎患者血清CD59、Gremlin-1表达及与近期预后的相关性

目的研究急性加重期特发性间质性肺炎(IIP)患者血清CD59、Gremlin-1水平及其与近期预后的相关性。方法选取2020年3月—2022年2月湖南中医药大学第一附属医院呼吸内科诊治的急性加重期IIP患者90例为研究对象(急性加重期组),以同期诊治的稳定期IIP患者60例为稳定期组,以同期体检的健康者60例为健康对照组。根据急性加重期IIP患者随访3个月生存情况,分为生存亚组(n=59)和死亡亚组(n=31)。酶联免疫吸附实验检测血清CD59、Gremlin-1水平。Pearson相关分析急性加重期IIP患者血清CD59、Gremlin-1与临床指标的相关性。多因素Logistic回归分析影响急性加重期IIP患者死亡预后的因素。受试者工作特征曲线分析血清CD59、Gremlin-1对急性加重期IIP患者死亡预后的预测价值。结果急性加重期组血清CD59、Gremlin-1高于稳定期组和健康对照组(t=30.916、47.431,34.379、54.420,P均<0.001)。死亡亚组患者ESR、HRCT评分,血清CD59、Gremlin-1明显高于生存亚组(t/P=2.580/0.012、4.546/<0.001、26.388/<0.001、20.842/<0.001)。急性加重期IIP患者血清CD59、Gremlin-1水平与ESR、HRCT评分呈正相关(r=0.621、0.736、0.705、0.689,P均<0.001)。HRCT评分、CD59、Gremlin-1是高影响急性加重期IIP患者死亡预后的危险因素[OR(95%CI)=1.589(1.258~2.006),1.593(1.252~2.028),1.733(1.249~2.404)]。HRCT评分,血清CD59、Gremlin-1及联合检测评估急性加重期IIP患者预后的AUC分别为0.807、0.779、0.752、0.867,以联合检测的AUC最大(Z=5.183、4.349、5.127,P均<0.001)。结论急性加重期IIP患者血清CD59、Gremlin-1水平升高,是影响急性加重期IIP患者死亡预后的影响因素,HRCT评分、血清CD59、Gremlin-1联合检测对急性加重期IIP患者死亡预后具有较高的评估价值。

基于生物信息学分析CD59在胰腺癌中的表达及预后影响

目的 通过生物信息学方法分析CD59在胰腺癌中的表达及预后意义。方法 利用基因表达谱交互分析2(gene expression profiling interactive analysis 2,GEPIA2)和人类蛋白组图谱(human protein atlas,HPA)数据库比较CD59在胰腺癌组织与癌旁组织中的表达差异;利用卡普兰麦尔(Kaplan-Meier plotter)数据库评价CD59表达水平对患者预后的影响;利用String和Cytoscape3.9.1软件分析CD59蛋白互作网络;利用DAVID6.8对CD59及关键的互作基因进行基因富集和通路富集分析。结果 与正常组织相比,CD59在胰腺癌组织中的表达显著上调(P<0.05),CD59高表达患者的总体生存时间(HR=2.3,95%CI:1.52~3.50)和无复发生存时间(HR=4.31,95%CI:1.57~11.83)较CD59低表达患者短。蛋白互作网络分析揭示CD59与CD55、GOLGA2、LMAN1、TMED2和SERPINA1等多个分子关系密切。基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析表明CD59主要参与补体激活、先天免疫反应和冠状病毒-COVID-19等通路。结论 CD59在胰腺癌组织中高表达,受免疫相关基因的影响,且与患者预后较差相关,可作为胰腺癌早期诊断及预测预后的标志物之一。

CD59促进LAT介导的T细胞活化

目的:研究CD59分子在LAT(Linker for activated T cells)介导的T系淋巴细胞活化中所起的作用。方法:构建LAT-GFP融合蛋白,以逆转录病毒为载体转染Jurkat细胞,建立稳定转染细胞株(Jurkat-GFP)。分别使用CD59抗体刺激和pSUPER-siCD59干扰质粒(GFP标记)沉默Jurkat-GFP细胞。免疫荧光观察CD59和LAT分子在细胞膜的表达和定位;MTT比色法检测细胞增殖率的变化;Western blot检测LAT活化信号转导通路中相关蛋白分子磷酸化水平。结果:荧光显微镜下可见Jurkat-GFP细胞绿色荧光表达于细胞膜,转染干扰质粒后细胞膜和细胞质均有绿色荧光表达。激光共聚焦显微镜下可见CD59抗体刺激前CD59和LAT分子均匀分布于细胞膜,且转染干扰质粒的Jurkat-GFP细胞CD59表达量下降。CD59抗体刺激后CD59分子和LAT分子点状聚集共定位于细胞膜。MTT结果表明相对于正常Jurkat-GFP细胞,抗体活化后细胞增殖速率明显升高(P>0.05),而电转干扰质粒后细胞生长减慢。Western blot结果表明,CD59抗体刺激后细胞ZAP-70、LCK、PLC-r总蛋白表达无明显差异(P>0.05),而磷酸化蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论:抗体活化后细胞膜上CD59和LAT分子聚集并共定位于细胞膜,且细胞信号转导通路下游分子磷酸化水平增高,进一步证实CD59分子经抗体活化后可促进LAT介导的T细胞信号转导。

CD59检测在阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断中的意义

目的 探讨CD5 9检测对阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (paroxysmalnocturnalhemoglobinuria ,PNH)及再生障碍性贫血 (AA) PNH综合征的临床诊断意义。方法 用FITC标记的CD5 9单抗 ,以流式细胞仪检测 13例PNH、37例AA和 2 0例正常人外周血红细胞和粒细胞膜表面CD5 9的表达情况。结果 正常人红细胞和粒细胞CD5 9表达阳性率均 >98% ;13例PNH患者红细胞及粒细胞CD5 9表达阳性率均 <90 % ;37例再障患者中 2 4例表达正常 ,13例红细胞或粒细胞CD5 9表达阳性率均有不同程度的减低。结论 CD5 9检测是诊断PNH较直接而又特异、敏感的方法 ,特别是对表现不典型的PNH及AA

树突状细胞负载Tα146-162对EAMG中Crry、CD59a、CD59b mRNA表达的影响

目的观察实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)小鼠肌肉中Crry、CD59a、CD59b mRNA的表达和Tα146-162-iMDC诱导免疫耐受对三者的影响。方法用GM-CSF、IL-10诱导骨髓细胞分化、增殖为不成熟的髓源性树突状细胞(iMDC),之后将Tα146-162负载其上(Tα146-162-iMDC)。健康雌性C57BL/6小鼠30只,随机分为模型组(A组,12只)、干预组(B组,12只)和正常对照组(C组,6只),A、B组小鼠用电鳗乙酰胆碱受体(T-AChR)免疫诱导EAMG,B组小鼠用Tα146-162-iMDC干预。按照Christadoss标准对小鼠进行EAMG评分,3H-TdR标记检测淋巴细胞增殖反应,RT-PCR方法检测Crry、CD59a、CD59b mRNA表达。结果A、B组小鼠平均临床评分分别是1.67±1.15vs0.33±0.65(P<0.01),发病率分别是75%vs25%(P<0.05)。B组较A组小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖反应明显降低(P<0.01)。A组较C组小鼠Crry mRNA、CD59a mRNA表达明显降低(P<0.05);B组较A组Crry mRNA、CD59a mRNA表达明显升高(P<0.05),B组CD59a mRNA与C组相比无显著性差异(P>0.05)。3组小鼠肌肉中均检测不到CD59b mRNA。结论Crry mRNA、CD59a mRNA表达减少可能参与EAMG发生,CD59b可能与EAMG发病无关;Tα146-162-iMDC上调小鼠肌肉中Crry、CD59a mRNA表达及抑制抗原特异性淋巴细胞增殖反应可能是其阻抑EAMG发生的机制之一。

突变人CD59分子真核表达体系的构建和功能的初步研究

构建突变人CD59分子(HMCD59)真核表达体系,探讨HMCD59糖基化前后抗补体活性的变化。采用重组PCR定点诱变技术在CD59易于糖基化的位点构建CD59突变基因,克隆入真核表达质粒pALTER-MAX。利用阳离子脂质体将重组质粒和pcDNA3共转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。G418压力筛选稳定转染细胞克隆,检测筛选HMCD59蛋白高表达株。免疫印迹技术(Western blot)检测出HMCD59蛋白分子量约为20kDa。2,7-二羧乙基-5,6羧基荧光素(BCECF)释放实验初步证实HMCD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为进一步研究糖尿病血管增殖症的发生机制提供了线索。

CD55、CD59、CD34对AA-PNH早期诊断研究应用

目的:探讨CD55、CD59、CD34抗原在再障阵发性血红蛋白尿综合征(AAPNH)的早期诊断中的价值,寻找AAPNH早期诊断敏感指标,进而达到早期发现、早期诊断、早期治疗的目的。方法:应用流式细胞仪测定AAPNH综合征患者的CD55、CD59、CD34抗原变化关系,并与PNH、AA等疾病组以及正常对照组CD55、CD59、CD34抗原相互变化关系,经过统计学处理,找出相关性。结果:结果表明AAPNH、PNHCD55、CD59、CD34抗原较AA及其他疾病组及正常对照组明显减低,并与溶血试验中溶血程度呈正相关,且早于其他溶血指标。结论:CD55、CD59、CD34抗原表达率可作为PNH、AAPNH综合征早期诊断最敏感指标,并与预后转归密切相关。

siRNA介导的RNAi降低了CD59对补体溶破的抵抗作用

目的:构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系,观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化,探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性CD59基因的重组载体,脂质体法转染A2780细胞,G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆,RT-PCR和Western blot检测转染细胞中CD59基因的表达抑制效果,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的影响。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确;重组载体转染A2780细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆,RT-PCR和Western blot表明,稳定转染后CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放试验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论:特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体以及稳定抑制的细胞系构建和筛选成功,CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用降低,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础。

新风胶囊对活动期类风湿关节炎患者的疗效及对血小板参数 血小板CD59的影响

目的:观察新风胶囊对活动期类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者的疗效及对血小板参数[血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)]、血小板CD59的影响。方法:检测60例活动期RA患者血小板参数、血小板CD59及各活动性指标(ESR、α1-AGP、CRP、RF),并将60例RA患者按随机数字表分为新风胶囊实验组35例和正清风痛宁对照组25例,治疗1个疗程后,观察两组的疗效和血小板参数、血小板CD59、各活动性指标的变化,另设正常对照组20例并检测上述指标。结果:①与正常对照组相比,活动期RA患者PLT、PCT、MPV显著升高,CD59显著降低(P<0.01或P<0.05);两治疗组总有效率相比无显著差异,但实验组显效率显著高于对照组(P<0.05);治疗后新风胶囊组及正清风痛宁组患者ESR、α1-AGP、CRP、RF显著降低,CD59显著升高(P<0.01或P<0.05);与正清风痛宁对照组相比,新风胶囊组PLT、PCT、ESR显著降低,CD59显著升高(P<0.01或P<0.05)。②PLT、PCT与IgG、ESR、CRP、RF、关节疼痛、关节肿胀呈正相关关系,PLT还与关节压痛和晨僵时间呈正相关,与CD59呈负相关(P<0.01或P<0.05)。结论:活动期RA患者血小板参数PLT、PCT显著升高,且与CD59、ESR、CRP、RF、IgG和关节疼痛、关节肿胀、关节压痛、晨僵时间具有相关性,提示PLT、PCT可以作为反映RA活动性的一项客观指标;新风胶囊能降低活动期RA患者PLT、PCT及炎症活动指标,其机制可能与提高血小板CD59的水平,抑制过亢免疫反应有关。

外周血粒细胞CD55,CD59和FLAER检测在贫血及PNH诊断中的意义

目的探讨CD55,CD59和嗜水气单胞菌毒素变异体(FLAER)检测在各类贫血及阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者诊断中的临床意义。方法选取2009年1月~2017年3月期间收集的30例健康对照,22例PNH,33例再生障碍性贫血(AA),37例缺铁性贫血(IDA),45例巨幼细胞性贫血(MA),30例溶血性贫血(HA)和31例骨髓增生异常综合征(MDS)患者,用多参数流式细胞仪同时检测外周血粒细胞CD55,CD59和FLAER阴性细胞比例,代表检出的PNH克隆数。结果 PNH,AA和MDS组FLAER检出率均高于CD55和CD59,但只有AA患者差异有统计学意义(X^2=7.759,5.518,P=0.005,0.019<0.05)。PNH和AA组CD55,CD59和FLAER阴性细胞比例均显著高于正常对照组及其他贫血组(t=2.163~17.890,P=0.000~0.038<0.05)。PNH组FLAER阴性细胞比例高于CD59,CD59高于CD55,差异均具有统计学意义(t=2.503~6.308,P=0.000~0.016<0.05)。结论 CD55,CD59和FLAER在PNH诊断及与其他贫血性疾病鉴别诊断中具有重要价值,尤其是存在微小PNH克隆的MDS和AA患者,FLAER优于CD59,CD59优于CD55。

藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究

探讨了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白（PC）对Hela细胞CD59基因表达的调控作用。以正常人CD59cDNA基因为模板，经PCR扩增后重组入真核表达质粒载体pALTER-MAX，然后利用阳离子脂质体（Lipfectamine-2000）将重组质粒和PcDNA共转染人子宫颈癌细胞（Hela）和对照用正常中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）进行表达。用不同浓度的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白作用于转染细胞，通过核酸分子杂交技术、免疫荧光标记法和ELISA法对细胞中CD59分子的表达进行检测。结果表明：成功构建了重组质粒pALTER-MAX．CD59，并将其导入真核细胞（Hela，CHO），经CAl8筛选获得了CD59分子高效表达的细胞克隆。用藻蓝蛋白作用于筛选出的转基因细胞，证实藻蓝蛋白可促进Hela细胞表面CD59蛋白的表达并抑制Hela细胞的增殖，而对于正常CHO细胞无明显作用。

锚定蛋白CD59与接头分子Cbp在T细胞上的定位及功能研究

目的研究CD59、Src羧基末端激酶结合蛋白(Cbp)在细胞膜的定位,及其在细胞活化及增殖中的相互作用。方法应用免疫荧光细胞化学技术,通过荧光显微镜分析系统对CD59、Cbp的定位进行了分析;Jurkat细胞转染pSUPER-siCD59重组质粒,并行RT-PCR和Western blot法检测转染细胞中CD59的表达及蛋白酪氨酸激酶癌基因家族(fyn)磷酸化水平。利用MTT比色法检测转染各组细胞的增殖效应。结果 CD59、Cbp主要分布在细胞膜上。转染pSUPER-siCD59重组质粒的Jurkat细胞中CD59表达量减少,磷酸化的fyn含量也随之减少,细胞增殖能力也低于其他各组。结论 CD59是一种膜蛋白,在细胞活化及增殖中与Cbp分子共同发挥作用。

下调CD59的表达可以抑制HeLa细胞增殖并促进其凋亡

目的采用RNA干扰与噬菌体肽库展示技术2种方法干预宫颈癌HeLa细胞CD59的表达,以探讨比较2种CD59低表达方式对HeLa细胞增殖与凋亡的影响。方法将10μg/mL的CD59短肽封条作用于HeLa细胞8 h后,联合CD59干扰质粒pSUPER-siCD59稳定转染HeLa细胞系,采用MTT法检测各组细胞增殖率的变化,采用TUNEL染色、annexin V-PE/7-AAD染色结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果 CD59短肽封条组与pSUPER-siCD59质粒稳定转染细胞组HeLa细胞增殖明显弱于对照组,TUNEL及流式细胞术检测结果显示2组处理细胞均存在细胞凋亡现象,且短肽封条的效果要好于pSUPER-siCD59质粒。结论下调CD59表达能抑制其细胞增殖并促进其凋亡,且短肽封条效果要优于CD59 RNA干扰质粒。

CD46 RNAi对CD59介导的T细胞信号转导的作用研究

目的构建携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59与CD46在介导T细胞信号转导中的相关性。方法将能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,转化大肠杆菌JM109并转染Jurkat细胞。将Jurkat细胞分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)、转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)及转染CD46干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅳ组)。用RT-PCR、Western blot技术检测各组细胞中的CD59、CD46基因的表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法检测CD46与CD59联合作用对4组Jurkat细胞的增殖效应。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确,构建成功,稳定转染后,Ⅳ组细胞CD46分子的表达被成功抑制,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD46与CD59单抗联合作用后,增殖能力明显高于Ⅲ组、Ⅳ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组之间无差异。结论 CD59可增强CD46对T细胞信号转导的效应。

脂筏微域内CD59趋引CBP蛋白介导T细胞下游信号的转导研究

目的探讨Cbp(Csk-binding protein)在Jurkat细胞中的过表达对其生物学功能的作用以及GPI锚定蛋白CD59通过Cbp对细胞的效应机制。方法构建Cbp-EGFP慢病毒载体,转染建立稳定的过表达Cbp-EGFP的Jurkat细胞株。采用免疫荧光技术,通过共聚焦显微镜观察CD59、Cbp的表达及定位关系;检测CD59抗体刺激前后细胞的增殖效率及细胞凋亡情况;Western blot检测Jurkat细胞中信号转导通路相关蛋白分子的变化。结果共聚焦显微镜下可见CD59、Cbp定位于胞膜上,在抗体刺激后,Cbp组与对照组均出现明显的荧光高亮聚集现象。转染Cbp-EGFP后细胞增殖速率明显降低(P<0.05),而中晚期凋亡现象显著高于阴性对照组(P<0.05)。CD59单抗作用前后相比,酪氨酸激酶蛋白(Fyn、Lck、ZAP-70)的表达量均有所下降,而Csk的表达量增加。结论 Cbp过表达能有效抑制Jurkat细胞的增殖,GPI锚固蛋白CD59可通过Cbp分子调控细胞信号转导通路中重要蛋白酪氨酸激酶的表达,进而影响Jurkat细胞的生物学活性。

下调Cbp分子促进GPI锚固蛋白CD59参与T细胞活化

目的采用RNA干扰技术构建针对Cbp基因的pSUPER-siCbp重组载体,以建立其高效转染表达体系。方法设计针对Cbp基因的寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSUPER载体中并进行鉴定。采用电转染方法转染Jurkat细胞,荧光显微镜观察GFP基因表达,并行RT-PCR和Western blot检测转染细胞中Cbp的表达。利用噻唑蓝(MTT)比色法检测转染重组载体前后各组Jurkat细胞的增殖效应;应用ELISA检测细胞上清中白介素2(IL-2)的变化水平,比较各组差异。结果经过限制性内切酶双酶切分析、DNA PCR和DNA测序鉴定,证实重组质粒pSUPER-siCbp的序列正确。转染重组质粒的Jurkat细胞,可表达绿色荧光蛋白,转染J2-pSUPER-siCbp重组质粒的Jurkat细胞中Cbp基因表达量明显低于其他各组;其细胞增殖能力,IL-2分泌高于其他各组。结论成功构建了靶向人Cbp基因的pSUPER-siCbp载体,转染Jurkat细胞中Cbp表达降低,为以后的CD59与Cbp在T细胞信号转导通路中相互作用研究奠定了基础。