CD8^+CIK细胞表面NKG2D及TCR抗原识别受体的功能分析

目的探讨CD8^+细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)亚群表面T细胞受体(TCR)和NKG2D(即CD314)抗原识别受体在发挥抗肿瘤特别是卵巢癌免疫效应中的功能。方法 CIK细胞由卵巢癌志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)制备而成,采用磁性细胞分选(MACS)技术从培养1周的CIK细胞中富集CD8^+亚群并继续培养扩增,获得高度均质性的CD8^+CIK细胞后进行表型检测。将CD8^+CIK细胞分别在CD3抗体和NKG2D抗体包被的培养板中进行培养,以CD137为CD8^+CIK细胞激活标志物,应用流式细胞术(FCM)检测CD137表达,评估CD8^+CIK细胞的激活状况。并检测经CD3抗体、NKG2D抗体刺激或与红白血病细胞株人类白细胞抗原(HLA)-主要组织相容性复合体-Ⅰ类相关分子(MIC)A/B+K562细胞共培养对CD8^+CIK细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)的影响。选用K562细胞作为CD8^+CIK细胞作用的靶细胞,应用NKG2D抗体阻断NKG2D与MICA/B相互作用,测试激活的CD8^+CIK细胞在NKG2D阻断状态下对靶细胞K562的杀伤能力。结果 TCR能够提供CD8^+CIK细胞的激活信号,而NKG2D不具备该功能。外周血单个核细胞(PBMC)中CD8^+细胞占24.2%,该细胞群中NKG2D阳性率为16.3%。CIK培养后CD8^+细胞比例增至88.1%,这些CD8^+CIK细胞均表达NKG2D,但其中仍含10%左右的CD8-细胞;CD3抗体组中CD137阳性率为88.8%;CD3抗体刺激后24h,约50%的CD8^+CIK细胞呈IFN-γ染色阳性,而NKG2D抗体刺激后,IFN-γ阳性率(4.8%和5.6%)高于对照组(2.9%),但明显低于CD3抗体;CD8^+CIK细胞经CD3抗体刺激24h后IFN-γ检测阳性率为41.9%,但与K562细胞按1:1比例共培养后阳性率仅为0.5%。CD8^+CIK细胞对K562细胞具有杀伤功能,即能够以HLA非限制的方式杀伤靶细胞。而在CD3-TCR复合物激活的CD8^+CIK细胞上阻断NKG2D与MICA/B相互作用后,CD8^+CIK细胞杀伤活性受到抑制。结论 CD8^+CIK细胞的激活主要通过CD3-TCR受体复合物,而非通过NKG2D受体。CD8^+CIK细胞的NKG2D受体与靶细胞表面相应配体结合后可以介导HLA非限制的抗癌功能,但NKG2D受体的此种作用比较有限。

MGBA抗原特异性CD8^+CTL细胞与CIK细胞杀瘤活性的对比研究

目的比较乳腺珠蛋白A(MGBA)抗原特异性CD8^+CTL细胞与CIK细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。方法从健康志愿者外周血中提纯单个核细胞,体外分离、诱导培养成树突状细胞(DC)、CTL和CIK细胞,用免疫磁珠法从CTL细胞中分选CD8^+CTL细胞;用表达乳腺珠蛋白的重组腺病毒(Ad-MGBA)转染DC细胞后,经刺激制备MGBA抗原特异性CD8+CTL与CIK细胞,用流式细胞术检测两种杀伤细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。结果 CD8^+CTL和CIK对表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-415细胞杀伤率分别是63.07%和48.35%(P <0.05);对不表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤率是14.62%和29.29%(P<0.05)。结论抗原特异性CD8+CTL对表达该抗原的乳腺癌杀伤效果高于CIK细胞,而对不表达该抗原的乳腺癌细胞的杀伤效果低于CIK细胞。

重组人纤维连接蛋白诱导的CIK细胞的生物学特性和对肺癌细胞株杀伤活性的体外研究

背景与目的CIK细胞是过继免疫治疗的重要手段之一,简化体外培养过程从而提高其增殖率和杀瘤活性仍是目前研究的一个热点课题。本研究观察重组人纤维连接蛋白(recombinant human fibronectin,RN)诱导CIK细胞的生物学特性,建立一种高效、简便的体外CIK细胞扩增方法。方法抽取10名健康人外周静脉血各50mL,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,分别采用RN诱导法和传统方法培养CIK细胞,记录细胞增殖数;用流式细胞术测定免疫细胞表型和分泌IFN-γ、IL-4、穿孔素和颗粒酶B细胞的百分比;用MTT法测定CIK细胞对4种人肺癌细胞株的体外杀伤率。结果RN诱导的CIK细胞扩增倍数为传统方法的2.0倍-3.5倍,具有统计学差异(P<0.05);RN诱导组和传统方法组CD3+CD16+CD56+细胞绝对数分别增加了3778倍和2069倍;RN诱导组细胞中CD3+CD8+细胞比例明显高于传统方法组(P<0.05);但CD3+CD4+细胞比例无统计学差异(P>0.05);对4种肺癌细胞株的体外杀伤活性无统计学差异(P>0.05)。RN诱导的CIK较诱导前:分泌IFN-γ的细胞比例明显增加;分泌IL-4的细胞比例略有降低;释放穿孔素、颗粒酶B的阳性细胞比例较诱导前增加。结论RN诱导法是一种高效、简便的体外扩增CIK方法,可以替代传统方法。