大鼠慢性局灶脑缺血区CD8抗原表达的免疫组织化学研究

本文目的在于探查免疫分子 CD8抗原在脑缺血区表达的状况 ,进而探讨免疫因素与慢性局灶脑缺血的病理联系。采用大脑中动脉阻塞的局灶脑缺血模型和免疫组织化学 ABC方法观察 3 6只成年雄性 SD大鼠脑缺血区 CD8抗原表达的细胞种类、分布形式和表达时程。结果证明 :慢性局灶脑缺血诱导脑缺血区 CD8抗原表达 ,其阳性细胞呈无突起的圆形和分支状二类。圆形细胞在脑缺血 3 d时 ,其数量显著增加 (P<0 .0 5 ) ,位于大脑皮质梗塞灶的边缘 ,阳性细胞于脑缺血 1周达到高峰 (P<0 .0 1) ,此时 ,大部分阳性细胞已迁移到梗塞灶中央区并显示为大小和形状不同的无突起的细胞。分支状的 CD8阳性细胞出现在大脑皮质梗塞灶周围和缺血侧尾壳核 ,其数量在脑缺血 3 d显著增加 (P<0 .0 5 ) ,于脑缺血 1周 (尾壳核 )和 2周 (大脑皮质 )时达到高峰 (P<0 .0 1) ,随后缓慢下降 ,分支状的 CD8阳性细胞主要分布于大脑皮质梗塞灶的“半影区”和尾壳核的背外侧区。结果表明 :慢性局灶脑缺血诱导 CD8阳性 T淋巴细胞在脑缺血区浸润以及小胶质细胞的反应和激活 。

女性系统性红斑狼疮外周血单个核细胞雌激素受体及CD_8抗原表达

为进一步阐明性激素对系统性红斑狼疮 (SLE)的影响 ,我们应用免疫组化的方法测定了 5 8例女性SLE患者及 30例正常对照外周血单个核细胞 (PBMC)雌激素受体 (ER)与CD8抗原的表达 ,结果表明 :活动期患者ER与CD8抗原表达百分率均升高 ,且活动期与非活动期比较 ,非活动期CD8抗原与ER表达百分率降低(P <0 .0 0 1) ,其ER与CD8抗原表达百分率呈直线正相关 (r=0 .41,0 .0 0 0 5 <P <0 .0 0 1) 。

原发性胆汁性肝硬化患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶特异性CD8+CTL表位预测及鉴定

目的鉴定原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)上的HLA-A觹0201限制性CD8+CTL表位,为临床探索特异性免疫治疗奠定基础。方法应用数据库SYFPEITHI预测PDC-E2上两段涵盖B细胞表位和CD4+T细胞表位的氨基酸序列(163～184aa和36～49aa)附近可能存在的HLA-A觹0201限制性T细胞表位,再通过T2细胞株、细胞增殖试验和细胞毒性检测分别分析各抗原肽与HLA-A觹0201的结合力、诱导患者外周血单个核细胞(PBMCs)增殖能力及抗原肽诱导的抗原特异性T细胞杀伤毒性,逐步鉴定HLA-A觹0201限制性CD8+CTL细胞表位。结果数据库初步预测到5个可能性较大的HLA-A觹0201限制性抗原肽,其中两个抗原肽(159～167aa和165～174aa)显示与T2细胞上HLA-A觹0201分子有较高的亲和力,这两个抗原肽能刺激大部分HLA-A觹0201阳性PBC患者PBMC增殖,并且由其诱导产生的CTL具有特异杀伤活性。结论位于PDC-E2内酯酰区上的KLSEGDLLA穴159～167aa)和LLAEIETDKA穴165～174aa雪是PBC患者体内HLA-A觹0201限制性的CD8+CTL表位。

NOD小鼠CD_8α^+抗原基因克隆载体的构建及其相关蛋白在树突状细胞中的表达

目的:构建NOD小鼠CD8α+抗原基因重组慢病毒载体,探讨其在树突状细胞(DCs)中的表达,阐明1型糖尿病(T1DM)的发病机理。方法:设计CD8α+基因特异性引物,从NOD小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增CD8α+基因,与质粒载体pCDF1-MCS2-EF1-COPGFP进行连接重组,经过转化、筛选、鉴定和序列测定后,应用Western blotting法检测CD8α+基因的表达。应用Nanofectin脂质体转染试剂将含有目的基因的质粒转染HEK293细胞,进行重组慢病毒载体包装,将包装后的重组慢病毒颗粒感染DCs,采用Western blotting法检测CD8α+蛋白的表达。结果:成功构建了NOD小鼠CD8α+抗原基因的重组质粒载体,重组表达载体经转染HEK293细胞获得了重组病毒的原液,重组病毒扩增后感染DCs,免疫荧光下可见DCs内含有绿色荧光蛋白(GFP)表达。结论:NOD小鼠CD8α+抗原基因重组病毒载体构建成功,且有相关蛋白表达。

乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗前后抗原特异性CD8^(+)T细胞功能分析

目的观察乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗前后外周血HBV抗原特异性T细胞的数量功能与临床预后的相关性。方法经HLA-A2分型检测选取46例患者,采用主要组织相容性复合物(MHC)-抗原肽四聚体标记技术,经流式细胞仪检测乙型肝炎肝硬化患者抗病毒治疗前后外周血HBV抗原特异性CD8^(+)T细胞百分比,并对其细胞因子分泌能力及表型进行检测分析。结果46例人类白细胞相关抗原HLA-A2阳性者中,检出抗原特异性CD8^(+)T细胞表达的为22例。TDF治疗后患者ALT为(31.29±18.42)U/L,较治疗前(124.05±29.18)U/L明显下降(t=72,P=0.015),HBV DNA全部转阴,转阴率为100%。治疗后抗原特异性的CD8^(+)T细胞数量为(1.15±0.37)%,明显高于治疗前的(0.65±0.25)%(t=59,P<0.01);治疗后γ干扰素为(6.86±2.08)%,明显高于治疗前(3.58±1.26)%(t=46,P<0.01);抗病毒治疗后HBV表位特异性的CD8^(+)T细胞表达抑制性因子PD-1的细胞百分比为(0.43±0.19)%,低于治疗前的(0.76±0.43)%(t=131,P=0.0084);HBV表位特异性的CD8^(+)T细胞表达活性因子CD28的细胞百分比为(1.03±0.45)%,高于治疗前的(0.56±0.26)%(t=100,P=0.0006)。结论乙型肝炎肝硬化患者外周血中抗原特异性CD8^(+)T细胞存在功能缺陷,经抗病毒治疗后抗原特异性CD8^(+)T细胞数量和功能有一定程度的增强。

Graves病患者血清sCD8测定的临床意义

目的 :探讨Graves病患者血清可溶性CD8抗原 (sCD8)测定的临床意义。方法 :参照国外文献 ,建立了人血清sCD8测定的酶联免疫吸附实验 (ELISA)方法。测定 40例正常人及 46例GD患者血清sCD8含量并作动态观察。结果 :GD组治疗前血清sCD8水平显著高于对照组 ,经丙基硫氧嘧啶 (PTU)治疗 2～ 7月后 ,病情缓解者sCD8明显下降 ,与治疗前有显著性差异 (P <0 0 0 1) ,而未缓解者持高不降。血清sCD8与T3、T4、TSH、TGA、TMA均无相关性。结论 :血清sCD8水平与GD病情活动性有一定相关性 ,并可能对预后判断有价值。PTU显示免疫抑制作用。

乙肝病毒核心抗原特异性CD8^+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与HBV-DNA、ALT的相关性研究

目的探讨乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原特异性CD8^+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)、谷丙转氨酶(ALT)的相关性。方法选择47例急性乙肝患者作为急性乙肝组,同期39例慢性乙肝活动期患者作为慢性乙肝组,同期28例健康体检者作为对照组,比较三组核心抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞及相关因子(Core18-27、Env335-343、Pol575-583)、HBV-DNA、ALT、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰基转移酶(GGT)、总胆红素(TBIL)水平,分析乙肝病毒核心抗原特异性CD8+细胞毒T淋巴细胞及相关因子与HBV-DNA、ALT的相关性。结果急性乙肝组Core18-27、Env335-343、Pol 575-583水平分别为(1.24±0.51)%、(0.09±0.01)%、(0.09±0.02)%,高于对照组的(0.09±0.02)%、(0.06±0.02)%、(0.07±0.02)%和慢性乙肝组的(0.05±0.01)%、(0.04±0.01)%、(0.03±0.01)%,且对照组均高于慢性乙肝组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。急性乙肝组HBVDNA、ALT、AST、GGT及TBIL水平分别为(21.59±4.32)×10^3 copies/ml、(85.35±5.49)U/L、(120.59±12.19)U/L、(125.98±13.42)U/L、(40.39±1.32)μmol/L,均高于慢性乙肝组的(13.21±3.29)×10^3 copies/ml、(62.14±5.05)U/L、(87.56±6.87)U/L、(102.12±10.06)U/L、(25.49±1.21)μmol/L和对照组的0、(32.21±3.25)U/L、(30.29±3.41)U/L、(33.49±3.09)U/L、(12.59±0.14)μmol/L,且慢性乙肝组高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Core18-27、Env335-343和Pol 575-583与HBV-DNA、AST、ALT、GGT及TBIL水平均呈正相关(P<0.05)。结论乙肝病毒核心抗原特异性CD8+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与HBV-DNA、ALT存在相关性,加强其表达水平测定反映疾病严重程度,有助于指导临床治疗。

登革热患者外周血CD4^+、CD8^+T细胞及IL-10的检测分析

目的:观察登革热患者外周血CD4+、CD8+T细胞及白介素-10(IL-10)的变化,探讨其在登革热疾病的发生和发展中的作用。方法:12例健康人和18例登革热患者于治疗前后采静脉血,采用流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞并计算CD4+/CD8+比值,ELISA法检测血清IL-10水平,同时作外周血白细胞、血小板计数。结果:与正常健康人和治疗后相比,登革热患者治疗前外周血CD4+细胞百分比、CD4+/CD8+比值明显降低(P<0.01),CD8+细胞百分比和血清IL-10显著增高(P<0.01),白细胞、血小板计数均明显下降(P<0.01);治疗后患者以上指标均与健康人无明显差异。结论:CD4+、CD8+T细胞在登革热病毒感染后异常激活,CD4+/CD8+比值明显降低,IL-10分泌增高,可能在登革热的发病中起重要作用。

红斑狼疮皮损中CD4^+和CD8^+T细胞的表达

目的检测红斑狼疮皮损区T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+T细胞的表达情况。方法采用免疫组织化学法对红斑狼疮皮损区淋巴细胞进行检测,并与正常皮肤作对照。结果红斑狼疮患者皮损CD4+T细胞百分数明显高于正常对照组。CD8+T细胞百分数明显低于正常对照组。结论红斑狼疮患者可能存在CD4+T细胞活性增强,CD8+T细胞功能抑制,从而导致免疫紊乱而发病。

胃癌患者外周血淋巴细胞CD_8、CD_(28)表达的检测及临床意义

目的探讨胃癌患者外周血淋巴细胞CD8、CD28的表达及其临床意义。方法用流式细胞术对48例胃癌患者和30例健康体检者外周血淋巴细胞CD8及CD28进行了检测。结果(1)胃癌组CD8+CD28-细胞与对照组比较明显增高(P<0.05),CD8+CD28+细胞则明显减低(P<0.01)。(2)胃癌患者手术后CD8+CD28-细胞明显低于手术前(P<0.01),CD8+CD28+细胞明显高于手术前(P<0.05)。(3)胃癌患者淋巴结转移组CD8+CD28-细胞明显低于未转移组(P<0.01)。(4)Ⅲ期胃癌患者CD8+CD28-细胞与Ⅰ期和Ⅱ期相比明显增高(分别P<0.01,P<0.05),随着临床分期的进程CD8+CD28+细胞、CD8-CD28+细胞逐渐减低(分别P<0.01,P<0.05)。结论检测胃癌患者的外周血中的CD8和CD28的表达,对了解患者的免疫状况,疾病进展和指导临床对患者进行免疫调节治疗方面有一定的价值。

系统性红斑狼疮患者外周血CD4^+和CD8^+细胞端粒长度及端粒酶活性的研究

目的:探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD 4+、CD 8+和CD 19+细胞端粒长度和端粒酶活性变化及其在发病中的作用。方法:用免疫磁珠法,从外周血单个核细胞分离CD 4+、CD 8+和CD 19+淋巴细胞,提取细胞蛋白后,用PCR为基础的端粒酶测定法(T e lom eric repeats am p lification protoco l,TRAP)测定端粒酶活性;Sou thernB lot测定细胞端粒长度。结果:SLE患者CD 4+、CD 8+和CD 19+细胞端粒酶活性均高于正常对照,但只有CD 19+细胞端粒酶活性与正常对照相比差异有显著性(P<0.05)。SLE患者CD 4+和CD 8+淋巴细胞的端粒长度均较正常对照明显缩短,CD 19+淋巴细胞的端粒长度无明显缩短。结论:SLE患者CD 19+细胞端粒酶活性显著增高,维持了细胞端粒长度;而CD 4+和CD 8+细胞端粒酶活性可能不足以维持由于细胞分裂所导致的细胞端粒缩短。

河南贲门癌高发区癌组织浸润淋巴细胞CD_4和CD_8及δγT的表达及意义

目的:探讨河南高发区贲门癌组织浸润淋巴细胞CD4、CD8和δγT的表达变化特征及其意义。方法:采用ABC和组织病理学方法,分析20例贲门癌组织和20例正常贲门对照组淋巴细胞CD4、CD8和δγT的表达状况。结果:贲门癌组织比正常组织CD8(68·05±29·85vs51·85±18·20,P=0·045)和δγT免疫阳性细胞数(7·50±4·24vs4·90±2·65,P=0·025)升高;贲门癌组织CD4免疫阳性细胞数比正常组织降低(68·35±28·73vs89·75±35·34,P=0·042);但是,正常组织CD4+/CD8+细胞比值明显高于贲门癌组织(1·88±0·76vs1·01±0·06,P=0·000)。结论:贲门癌患者免疫功能异常,可能与贲门癌变有关。

HepA-H和HepA-L肝癌荷瘤小鼠CD8^+/CD28^+T细胞和肿瘤新生淋巴管的研究

目的研究不同淋巴转移潜能肝癌(H epA-H和H epA-L)荷瘤小鼠体内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞和肿瘤新生淋巴管,探讨与肿瘤淋巴转移的关系。方法用两种来源相同,而淋巴转移能力不同的小鼠肝癌细胞亚系,H epA-H(高淋巴转移)和H epA-L(低淋巴转移),小鼠皮下接种,制备荷瘤动物模型。采用抗小鼠CD 8、CD 28荧光标记单克隆抗体,流式细胞术定量检测小鼠外周血和肿瘤组织内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量;应用5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶双重组化染色法,观察肿瘤新生淋巴管。结果肿瘤皮下接种后14天,H epA-H组荷瘤小鼠外周血CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量明显低于正常对照组(P<0.05);H epA-H组肿瘤组织内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量显著低于H epA-L组(P<0.05)。两种肿瘤细胞亚系均可诱导肿瘤新生淋巴管,但H epA-H肿瘤内和瘤周最高淋巴管密度均明显高于H epA-L组(P<0.01)。结论肿瘤淋巴转移能力的差异与体内CD 8+/CD 28+T淋巴细胞数量及肿瘤新生淋巴管有关。

CD8和CD10在宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞中的表达及意义

目的研究宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)CD8、CD10的表达,分析其与宫颈癌临床病理特征及预后的关系,探讨影响宫颈癌患者预后的因素。方法收集所选患者完整的临床和病理资料,采用免疫组织化学染色法检测宫颈癌TIL CD8、CD10的表达情况。结果 (1)CD8在宫颈癌TIL中的表达随患者年龄的增加、临床病理分期的进展和淋巴结转移的出现而减弱(P<0.05);(2)CD10在宫颈癌TIL中的表达水平较低,且其表达与宫颈癌的临床病理特征及预后无明显相关性(P>0.05);(3)影响宫颈癌预后的因素为年龄、临床分期、CD8表达水平、有无淋巴结转移等,而与肿瘤的组织学类型无关;(4)CD8可作为宫颈癌预后的独立影响因素,且与CD10表达水平的改变不具有一致性(P>0.05)。结论宫颈癌TIL CD8的表达与患者手术时的年龄、临床病理分期及有无淋巴结转移相关,可作为宫颈癌预后的独立影响因素,但与CD10的表达无明显相关性。

小鼠CD4、CD8膜外区编码cDNA的克隆与表达

目的 克隆并表达小鼠CD4和CD8基因,以期制备其抗体为疫苗研究服务。方法 从小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT PCR技术克隆CD4、CD8α和CD8β膜外区片段的编码cDNA,利用谷光苷肽硫基转移酶 (GST)融合表达载体pGEX CS对其进行表达,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和Westernblot对重组蛋白进行鉴定。结果 以小鼠脾细胞总RNA为模板,分别扩增出小鼠CD4、CD8α和CD8β膜外区片段的编码cDNA,将其插入表达载体pGEX CS,得到重组质粒pGEX CSCD4、pGEX CSCD8α和pGEX CSCD8β。将所获表达载体转化E.coliBL21,用IPTG诱导表达,SDS PAGE检测表明小鼠CD4、CD8α、CD8β片段均得到成功表达,其表达量可占菌体蛋白总量的 30%左右,且均可与抗GST抗体反应。结论 成功克隆、表达了小鼠CD4、CD8α和CD8β,为进一步制备抗体从而用于免疫学研究打下了基础。

肝脏CD4、CD8及CD68表达与Kasai术后胆管炎的关系研究

目的探讨T淋巴细胞表面抗原CD4、CD8、巨噬细胞特异性抗原CD68表达与胆道闭锁肝门-空肠吻合术(Kasai术)后胆管炎的关系。方法选取Kasai术后行肝移植手术的27例胆道闭锁患儿,根据既往胆管炎发作情况将其分为频发胆管炎组(10例)、早期胆管炎组(7例)和无胆管炎组(10例),比较各组患儿的一般临床资料。取患儿肝移植时病肝的肝门部肝组织,行HE染色观察肝纤维化、胆管增生、肝组织炎性细胞浸润程度及胆栓情况,免疫组织化学染色检测CD4、CD8及CD68蛋白表达情况。结果3组患儿性别、年龄、Kasai手术年龄、自体肝生存时间、肝移植时白细胞计数、C反应蛋白及肝功能指标差异均无统计学意义;HE染色示3组患儿肝纤维化、胆管增生及胆栓分级差异均无统计学意义,而频发胆管炎组汇管区炎性细胞浸润程度较无胆管炎组和早期胆管炎组严重;免疫组化染色显示3组患儿CD4蛋白表达差异无统计学意义;频发胆管炎组CD8、CD68蛋白表达水平均高于无胆管炎组和早期胆管炎组(P<0.05)。结论Kasai术后胆管炎肝脏病理改变主要为CD8+T细胞及CD68+巨噬细胞参与的炎症反应,CD8及CD68表达增高可能是胆管炎反复发作的危险因素。

良性前列腺增生组织中CD8、CD20、IL-6和IL-23的表达

目的:探讨CD8、CD20、白细胞介素(IL)-6和IL-23在良性前列腺增生(BPH)发生与进展中的作用。方法:收集60例BPH患者的临床资料及手术标本,采用免疫组化技术检测CD8、CD20、IL-6和IL-23在增生前列腺组织中的表达,并与患者的临床资料进行对比分析。结果:CD8、CD20、IL-6、IL-23的阳性表达率分别为83%(50/60)、60%(36/60)、78%(47/60)和55%(33/60)。4种检测指标均为阴性表达者共9例(A组),包含2～3种指标为(+)和(++)表达者共32例(B组),4种指标均为(++)表达者11例(C组)。3组间前列腺体积比较显示C组>B组>A组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。I-PSS评分显示A组与B组均低于C组(均P<0.01),A组与B组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:BPH组织中存在明显的炎症细胞标志物和炎性因子的过表达,炎症免疫可能在BPH的发生与进展中起到一定的作用。

肿瘤微环境代谢重编程调控耗竭性CD8^(+)T细胞研究进展

CD8^(+)T细胞耗竭是免疫疗法低应答率的重要原因之一。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞优先利用有氧糖酵解等代谢重编程方式来使其获得优势生存,其所造成的缺氧、营养物质的消耗以及代谢有毒废物产生等特定的微环境应激会抑制CD8^(+)T细胞代谢并影响其分化。研究表明,耗竭CD8^(+)T细胞可发生代谢功能不全,伴随着信号级联和表观遗传背景的改变,从而抑制效应性免疫,并导致对免疫检查点阻断治疗反应不良。了解功能受损的耗竭性CD8^(+)T细胞其代谢改变,以及在肿瘤微环境中CD8^(+)T细胞与肿瘤细胞之间的代谢交互作用,并以此将代谢干预与免疫治疗相结合,或许是恢复T细胞的抗肿瘤活性的重要策略之一。因此,本文对CD8^(+)耗竭性T细胞其代谢特征以及在肿瘤微环境中异常代谢紊乱对CD8^(+)T细胞耗竭功能影响和靶向治疗等作一综述。

p38抑制剂对辐射损伤小鼠中免疫细胞的作用

目的:探讨利用p38抑制剂SB203580(SB)抑制p38通路对6Gy受照小鼠免疫细胞辐射损伤的作用。方法:取雄性C57BL/6小鼠30只,随机分为对照组、照射组和SB组,每组10只。SB组和照射组小鼠接受以6Gy137Csγ射线的全身照射。SB组小鼠照射24h后腹腔注射SB(15mg/kg),每2d1次,共给药5次,其余2组小鼠腹腔注射对照溶液。小鼠受照10d后处死,取外周血计数,流式细胞仪检测CD4、CD8、B220表达,取骨髓细胞测定ROS水平。结果:照射组外周血白细胞(WBC)、CD8、B220细胞比例较对照组明显下降,骨髓ROS水平升高(P<0.01)。SB组外周血CD8比例较照射组上升,骨髓ROS水平下降(P<0.01)。结论:SB对小鼠6Gy照射后造血免疫损伤有一定的缓解作用,其机制可能与其降低照射后骨髓细胞ROS水平有关。

T淋巴细胞亚群检验血标本在18~28℃温室或4℃冰箱过夜与当日标本检验结果对比研究

目的为了解决血标本在采集后4h内检验限制和确保检验结果的准确性,同时满足患者和临床医生的需求,对T淋巴细胞亚群检验血标本的不同存放时间、存放温度条件的检验结果与标准方法进行对照研究。方法抗凝管中的抗凝血一半当日检验,另一半标本置于18∽28℃温室或4℃冰箱过夜,于次日再测定。检验方法用实用单克隆抗体SPA花环（McAb-A-E）直接法。结果用20例标本对比结果,用SPSS19.0统计软件,经配对t检验对检验结果进行处理分析,两组CD3（t=-1.025,P=0.318）、CD4（t=-1.468,P=0.159）、CD8（t=-1.408,P=0.175）、CD4/CD8（t=-0.481,P=0.636）比较,四项结果的差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论抗凝血标本在18∽28℃温室或4℃冰箱过夜,T淋巴细胞亚群检验结果与当日相比无变化,即并不影响淋巴细胞CD3、CD4、CD8抗原性,也不影响实用McAb-A-E直接法对其抗原性的测定。