胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、Ang与复发性流产女性早孕期复发流产的关系

目的:探究胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、血管生成素(Ang)与复发性流产(RSA)女性早孕期复发流产的关系。方法:选择126例RSA患者为研究对象(RSA组),另选取94例正常早孕行人工流产术者为对照组。采用RT-qPCR、Western blot法检测胎盘绒毛组织CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表达水平,采用电化学发光法检测血清人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平,计算Ang-1/Ang-2 mRNA及蛋白比值,比较两组患者检测结果。结果:RSA组CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白表达和Ang-1/Ang-2 mRNA及蛋白表达比值均高于对照组,血清HCG水平低于对照组(P<0.05)。RSA组CD81 mRNA与Ang-1、Ang-2 mRNA呈正相关(P<0.05);RSA组CD81蛋白表达量与Ang-1、Ang-2蛋白表达量呈正相关(P<0.05),血清HCG水平与其他指标无相关性(P>0.05)。CD81、Ang-1/Ang-2的mRNA及蛋白和血清HCG均可用于预测RSA女性早孕期复发流产。结论:RSA女性早孕期复发流产与胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表达量异常高表达有关,CD81、Ang-1、Ang-2可能影响胎盘血管形成而致流产。

膜蛋白CD81增强滋养细胞的黏附能力及机制研究

目的探讨CD81对滋养细胞黏附能力的影响及可能机制,以便阐明CD81参与子痫前期发病的具体机制。方法体外培养永生化的人孕早期绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞,并感染高表达CD81的腺病毒(Ad-CD81)或转染抑制内源性CD81的干扰RNA(si-CD81)。采用细胞黏附实验检测HTR-8/SVneo细胞的黏附能力,采用免疫印迹法检测HTR-8/SVneo细胞中黏着斑激酶(FAK)的表达情况。结果与感染Ad-CTL的细胞相比,感染Ad-CD81的HTR-8/SVneo细胞黏附能力增强,570 nm处的光密度值显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与转染si-CTL的细胞相比,转染si-CD81的HTR-8/SVneo细胞黏附能力减弱,570 nm处的光密度值显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。随着Ad-CD81浓度的增加,感染Ad-CD81的HTR-8/SVneo细胞中FAK的蛋白表达较Ad-CTL感染细胞逐渐下降(P<0.05或P<0.01)。随着si-CD81浓度的增加,转染si-CD81的HTR-8/SVneo细胞中FAK的蛋白表达较si-CTL转染细胞逐渐增加(P<0.05或P<0.01)。结论膜蛋白CD81可增强滋养细胞的黏附能力,其分子机制可能与CD81抑制滋养细胞中FAK的蛋白表达有关。

B-ALL患儿骨髓中CD123、CD81与预后关系

目的:分析急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿骨髓中CD123、CD81与预后关系。方法:检测医院98例B-ALL患儿骨髓中CD123、CD81表达情况,分析二者与随访1年疾病复发的关系。结果:98例患儿中20例复发;不同预后患儿骨髓中CD123、CD81阳性率及危险度比较差异有统计学意义(P<0.05);Cox回归分析显示骨髓中CD123、CD81阳性表达与患儿预后不良有关(P<0.05);ROC曲线显示骨髓中CD123、CD81阳性表达对B-ALL患儿预后不良有一定预测价值。结论:B-ALL患儿预后不良与骨髓中CD123、CD81阳性表达有关。

复发性流产再孕早期流产因素分析及胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、血管生成素评估价值

目的:探讨复发性流产女性再妊娠胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、血管生成素(Ang)水平及评估早孕自然流产发生价值。方法:选取2019年6月-2021年3月本院就诊的复发性流产再孕早期自然流产105例纳入流产组,正常早孕要求人工流产终止妊娠110例纳入对照组,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测两组胎盘绒毛中CD81、Ang1、Ang2 mRNA水平,采用受试者工作曲线(ROC)分析上述3项指标对复发性流产女性再孕流产的评估价值,通过logistic回归分析复发性流产再孕流产发生的危险因素。结果:流产组胎盘绒毛组织CD81(2.33±0.51)、Ang1(0.36±0.11)、Ang2(0.38±0.12)mRNA表达水平均高于对照组(1.67±0.33、0.18±0.05、0.17±0.04)(均P<0.05);胎盘绒毛组织CD81、Ang1、Ang2 mRNA联合检测评估复发流产再孕自然流产的曲线下面积为0.898,高于各指标单独检测(0.786、0.817、0.801)(P<0.05);生殖系统感染、内分泌异常、合并自身免疫性疾病、胎盘绒毛组织CD81 mRNA、Ang1 mRNA、Ang2 mRNA高表达是复发性流产女性再孕自然流产发生的危险因素。结论:复发性流产女性再孕自然流产的发生与胎盘绒毛组织中CD81、Ang1、Ang2高表达有关,检测该3项指标可在一定程度上评估复发性流产再发生。

HBeAg与CD81分子结合的研究

目的 :研究HBeAg与CD81分子在细胞内、外的相互作用。方法 :应用RT PCR技术 ,从HepG2细胞中扩增CD81全基因 ,并构建重组真核表达载体。将其与pGBKT7 eAg共转染营养缺陷型酵母细胞 ,观察生长情况。应用网织红细胞裂解体外翻译及免疫共沉淀试验 ,进一步验证CD81分子与HBeAg的结合。结果 :经EcoRI和BamHI酶切和DNA序列测定鉴定表明 ,构建的CD81基因的重组表达载体正确。共转染后的酵母细胞在营养缺陷的培养基中生长良好。体外免疫共沉淀试验证实 ,CD81与HBeAg出现沉淀带。结论 :HBeAg与CD81分子在细胞内、外均可结合 。

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

以高效原核表达载体pCold TF为载体骨架,应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法,将pCold TF中的六聚组氨酸(His-Tag)序列替换为限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT,构建不含His-Tag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时,通过PCR引物在目的基因3′端添加His-Tag以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Trigger Fac-tor(TF)助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化,并使用Fac-tor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白,获得3′端含有His-Tag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化,为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.

抗CD81抗体对培养大鼠RG的增生抑制作用

目的观察抗CD81抗体EAT2和H121对培养大鼠视网膜神经胶质细胞(RGC)增生活性的影响。方法分别将2μg/ml、10μg/ml抗CD81抗体EAT2和H121加入体外培养SD大鼠RGC中,7d后以MTT法测定细胞生长抑制率。结果加入抗CD81抗体后RGC增生活性下降,H121对RGC的细胞生长抑制率可达50.37%。结论抗CD81抗体EAT2和H121可以抑制培养大鼠RGC的细胞增殖活性。

抗CD81抗体对星形胶质细胞增殖的抑制作用

目的研究抗CD81抗体在星形胶质细胞增殖中的作用。方法将纯化的星形胶质细胞分为6组,加入不同浓度抗CD81抗体,其浓度依次为0、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L,以四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性。在此检测结果的基础上,选出3个有意义的浓度组,加入浓度分别为0、0.5mg/L、5mg/L的抗CD81抗体,采用流式细胞术观察抗CD81抗体对星形胶质细胞周期的影响并进行统计学分析。结果抗CD81抗体对星形胶质细胞的增殖有抑制作用,并呈一定的剂量依赖性。加入抗CD81抗体培养24 h后,实验组的星形胶质细胞处于G0/G1期的细胞指数减少,S期细胞指数增多。结论抗CD81抗体抑制了星形胶质细胞的增殖,使星形胶质细胞的细胞周期受阻,阻滞于S期。

四次跨膜蛋白CD81促进人绒毛外滋养细胞失巢凋亡的初步研究

目的:探讨四次跨膜蛋白CD81表达对人妊娠早期绒毛外滋养细胞失巢凋亡的作用。方法:构建CD81的高表达质粒(pCS2-CD81),将pCS2-CD81或CD81特异的小干扰RNA(siCD81)瞬时转染至人妊娠早期绒毛外滋养细胞(HTR-8/SVneo细胞),同时转染pCS2-EV或siRNA control作为对照组。实时荧光定量PCR(QRT-PCR)和Western blot法检测pCS2-CD81及siCD81在HTR-8/SVneo细胞中的表达效率。采用聚甲基丙烯酸2-羧乙基酯(poly-HEMA)包被的培养皿模拟细胞悬浮培养的环境,采用Annexin V/PI双染法分别检测CD81对正常贴壁生长及悬浮培养的HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响。结果:成功构建CD81的高表达质粒(pCS2-CD81)。与转染pCS2-EV比较,瞬时转染pCS2-CD81的HTR-8/SVneo细胞高表达CD81蛋白(P<0.05);与转染siRNA control比较,siCD81有效抑制HTR-8/SVneo细胞的内源性CD81表达(P<0.05)。过表达CD81或抑制内源性CD81表达对HTR-8/SVneo细胞的普通凋亡无显著影响,但过表达CD81可显著促进HTR-8/SVneo细胞的失巢凋亡(P<0.05),抑制内源性CD81表达能减少HTR-8/SVneo细胞的失巢凋亡达15.5%(P<0.05)。结论:四次跨膜蛋白CD81促进人妊娠早期绒毛外滋养细胞的失巢凋亡。

人CD81分子的肝组织特异性稳定表达

目的:用肝组织特异性启动子,实现人CD81分子在小鼠肝癌细胞Hepa 1-6中的稳定表达。方法:从能感染丙型肝炎病毒(HCV)的人肝癌细胞系HepG2中提取RNA,用随机引物合成cDNA的第1条链,然后用人CD81基因的特异性引物进行PCR扩增,克隆PCR扩增片段。将经测序证明为人CD81基 因的正确序列,连接到肝特异性启动子的下游,使CD81基因的3’端与SV40 polyA加尾序列融合,得到肝组织特异性表达的人CD81融合基因片段。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3中,转染小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6。经G418加压筛选后,分别用RT-PCR检测人CD81 mRNA的转录,用FACS检测人CD81蛋白的表达。结果:克隆序列的测序结果与GenBank中登录的序列进行对比表明,得到了人CD81 cDNA的正确序列。构建的人CD81肝特异性融合基因片段可稳定转染Hepa 1-6细胞,并可检测到人CD81在mRNA水平上的转录和在蛋白质水平上的稳定表达。结论:由于CD81是HCV的感染受体,稳定表达HCV感染受体-人CD81分子的小鼠肝癌细胞克隆的获得,为今后研究HCV包膜蛋白与CD81的相互作用、筛选感染阻断药物,以及发展HCV感染的小鼠动物模型奠定了基础。

草鱼CD81基因的克隆及功能分析

为研究白细胞表面分化抗原81(CD81)的功能,对草鱼CD81进行了克隆,CD81全长共1376 bp,其中5′非翻译区87 bp,3′非翻译区581 bp,开放阅读框为708 bp,包括8个外显子,7个内含子,编码235个氨基酸。实验采用实时荧光定量PCR的方法检测了CD81在健康草鱼不同组织中的表达情况及草鱼出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表达变化情况。结果显示草鱼CD81在所有被检测组织中均有表达,在头肾中表达量最高。在GCRV攻毒前后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81表达量均有明显变化。同时,采用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪CD81的亚细胞表达部位,激光共聚焦显微镜显示,同人类一样,草鱼CD81定位于细胞膜上。

抗CD81抗体对培养大鼠RPE增殖性的影响

目的:观察抗CD81抗体EAT2和H121对培养大鼠视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,RPE)增殖活性的影响。方法:分别将2,10mg/L抗CD81抗体EAT2与H121加入体外培养大鼠RPE中,7d后以MTT法测定细胞生长抑制率。结果:加入抗CD81抗体后RPE增殖活性下降,10mg/LEAT2对RPE的细胞生长抑制率达72.7%。抑制作用的强弱随抗体种类及抗体浓度的不同而不同。结论:抗CD81抗体EAT2和H121可以抑制培养大鼠RPE的细胞增殖活性。

慢病毒载体介导HCV受体基因OCLN/CD81转染对树鼩骨髓间充质干细胞的影响

目的观察在体外培养条件下,慢病毒载体介导的HCV受体基因OCLN/CD81转染对树鼩骨髓间充质干细胞生物学特性的影响及基因的表达情况。方法利用本室分离鉴定保存的树鼩BM-MSCs,构建含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体,并分别将CD81和OCLN基因转染到BM-MSCs中,荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测转染效率,CCK8法检测转染后BM-MSCs的细胞增殖情况,成骨成脂细胞诱导分化检测其多向分化潜能。采用实时荧光定量及WB方法检测HCV受体(OCLN/CD81)基因mRNA和蛋白表达情况和转染后BM-MSCs干性基因的表达。结果以MOI为100转染含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体后,LV-CD81转染效率达99.4%,LV-OCLN转染效率22.6%。细胞增殖趋势与未转染基因的BM-MSCs相似,转染后的BM-MSCs仍可以向成骨成脂细胞分化,但能力有所下降。干性基因NANOG mRNA表达增高,差异有显著性(P<0.05),LIN28A mRNA表达下降,差异有显著性(P<0.05)。转染后树鼩BM-MSCs能高效表达所转入的外源基因。结论构建的含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体可以成功转染树鼩BM-MSCs,并高效表达所转入的基因,转染后对树鼩BM-MSCs的多向分化潜能有一定的影响。

丙肝病毒受体CD81与肝外胆管癌的相关性

目的:探讨肝外胆管癌与丙型肝炎病毒受体CD81的相关性。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法(SP法)检测62例肝外胆管癌及30例胆道良性病变组织中HCVRNA、CD81mRNA序列片段以及HCVNS5抗原、CD81蛋白的表达。结果:肝外胆管癌组织中HCVRNA和CD81mRNA的阳性率分别为58.1%和72.6%,与对照组相比差异有显著性(#2=22.030,P<0.001;#2=7.453,P<0.01);HCVRNA阳性的肝外胆管癌组织CD81mRNA表达率为55.6%,HCVRNA阴性的CD81mRNA表达率为96.2%,两者差异有显著性(#2=12.503,P<0.001);免疫组化检测均有类似结果。HCVRNA阳性肝外胆管癌的CD81mRNA丢失与否与分化状况有关(#2=14.103,P<0.01);分化Ⅳ级与Ⅰ级的CD81mRNA丢失差异有显著性(P<0.05/3)。结论:肝外胆管癌组织中有HCV基因的高表达;CD81作为HCV感染胆管细胞的受体与肝外胆管癌分化有一定的相关性。

人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:构建人CD81-LEL基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法:通过PCR扩增得到CD81-LEL基因编码区片段,与pMD18-T载体连接,经序列测定后,再将该扩增片段亚克隆入原核表达载体pET32a(+)中。酶切鉴定正确的表达载体pET32a-CD81-LEL转化表达菌BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白。结果:成功构建了原核表达载体pET32a-CD81-LEL;SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达且呈可溶性状态,Western-blot显示目的蛋白正确表达,并用镍离子亲和层析法获得纯化的重组蛋白。结论:CD81-LEL可以在大肠杆菌中表达,为进一步研究CD81与丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E2的结合提供了有用的研究资料。

CD81在正常大鼠神经视网膜上的表达

目的观察CD81在正常大鼠神经视网膜上的表达。方法用抗CD81抗体对正常大鼠视网膜组织进行免疫组织化学染色,并对神经视网膜进行Western blot分析,同时用细胞免疫组织化学染色法检测体外培养视网膜神经胶质细胞的CD81表达。结果大鼠视网膜神经节细胞层、内丛状层和外丛状层呈阳性网状致密染色;Western blot分析神经视网膜层出现CD81阳性条带;体外培养的大鼠视网膜神经胶质细胞也呈CD81阳性表达。结论正常大鼠的神经视网膜表达CD81,视网膜神经胶质细胞是表达CD81的一种细胞类型。

猪CD81的克隆、序列分析及其LEL区原核表达

为研究猪CD81基因特征及对其进行原核表达,本研究从猪PBMC的总RNA中扩增获得CD81全基因,测序后经比对分析表明,与已报道的序列同源性为99.7%～100%,与牛羊的同源性约为92%,其次为灵长类(约90%),大鼠和小鼠最低(约87%)。氨基酸序列分析其SEL和LEL区为主要变异区,尤其LEL区在不同物种间变异较大。进一步扩增其LEL区基因并以pGEX-4T-1为载体构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达重组蛋白,其主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,重组蛋白以GST融合蛋白形式表达。

高表达CD81的Huh7细胞株对提高HCV病毒感染效率的研究

目的建立具有高感染性的丙型肝炎病毒(HCV)的体外细胞株。方法构建高表达CD81的Huh7细胞株。将HCV质粒(JFH-1,2a)体外转录成RNA,电转染到Huh7和CD81-Huh7细胞中,实时定量PCR法检测两组细胞和培养上清液中病毒载量,间接免疫荧光法检测细胞中HCV核心蛋白表达。收集电转后细胞上清液重新感染两组细胞,检测细胞中病毒RNA表达。结果 CD81-Huh7电转后,细胞和上清液中病毒RNA水平均明显高于Huh71-2log。其被感染的效率也高于Huh7。结论成功建立一株能够高表达感染性HCV病毒颗粒的细胞株CD81-Huh7。

pcDNA3.1-CD81载体在人肝癌细胞中的表达及意义

目的 研究人白细胞分化抗原CD81真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81在人肝癌细胞系HepG2 中的表达及意义。方法 由人Molt 4细胞提取细胞总RNA ,根据已公布的序列设计引物 ,运用RT PCR及PCR方法扩增出人CD81基因 ,应用TA克隆插入PMD 18T载体 ;定向克隆入真核表达载体pcDNA 3 .1(+ ) ;通过脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2 ,用免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术检测目的蛋白的表达。结果 由RT PCR及PCR方法扩增出人CD81编码基因与Genebank公布的序列完全一致。重组真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81经酶切和PCR鉴定分析正确。免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术证明转染的HepG2 细胞表面能有效地表达CD81蛋白。结论 所构建的pcDNA3 .1 CD81真核表达载体在HepG2 细胞有良好的表达 ,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供细胞模型 ,为研究丙型肝炎病毒 (HCV)与CD81相互作用奠定基础。