靶向CD99的CAR-T细胞扩增优化研究

背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果显著,但对实体瘤效果较差,这与靶点选择的因素有关。针对尤因肉瘤(Ewing sarcoma,ES),CD99可作为CAR-T细胞潜在的靶点。由于T细胞自身表达CD99蛋白,靶向CD99的CAR-T细胞存在体外扩增能力有限的问题。本研究旨在通过增加CD99敲低的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、优化慢病毒转导的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、筛选培养CAR-T细胞的培养基及培养容器,以获得CD99 CAR-T细胞制备的最优条件。方法:筛选shRNA序列,提高CD99 CAR-T细胞的扩增能力。采用不同的MOI、培养基和培养容器,分别检测在不同条件下CAR-T细胞的转导效率、细胞存活率、增殖能力、特异性杀伤能力及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)释放水平等,筛选出最优的细胞制备条件。结果:通过shRNA敲低得到的KO-CD99 CAR-T细胞扩增水平显著高于CD99 CAR-T细胞[(16.40±0.40)vs(6.33±1.53),P<0.01]。转导MOI为0.25~1.0、培养基为OptiVitro时细胞的扩增效果最优。在透气瓶中培养的CAR-T细胞扩增倍数显著高于在培养袋中培养的细胞[MOI=0.25:(50.23±3.32)vs(13.02±4.82);MOI=0.50:(49.96±0.83)vs(18.25±2.88);MOI=1.00:(48.27±5.08)vs(13.16±6.26);P<0.01],且细胞分型更优、特异性杀伤更高。结论:通过shRNA技术得到的KO-CD99 CAR-T细胞可实现稳定扩增。从扩增条件优化结果看,MOI为0.25~1.00,培养基为OptiVitro,培养容器为透气瓶的条件下,KO-CD99 CAR-T细胞可获得更优的扩增能力、更多比例的记忆T细胞,为后续开展CD99 CAR-T细胞治疗ES的临床试验奠定了坚实基础。

CD99在尤因肉瘤中的作用及其靶向治疗

CD99是一种主要定位在细胞膜上的Ⅰ型跨膜糖蛋白,参与调控正常组织细胞的分化、黏附、迁移和蛋白运输等功能。CD99蛋白在大多数正常组织中表达较低,但在一些恶性肿瘤,尤其是尤因肉瘤(EWS)中高表达,可作为EWS的辅助诊断和预后标志物。高表达的CD99蛋白可通过多种机制促进EWS的发生发展,例如与配体结合、影响外泌体相关的miRNA分泌和调控下游信号通路等。作为在EWS细胞中高特异性表达并发挥促癌作用的膜蛋白,CD99是理想的肿瘤治疗靶点,已有研究尝试开发通过靶向CD99治疗EWS的方法,包括CD99中和抗体、小分子抑制剂和肿瘤疫苗等。尽管目前靶向CD99治疗EWS还处于临床前研究阶段,但已展现出很好的治疗前景。因此,针对CD99的靶点干预可能为EWS治疗提供新策略。

CD99^+/mCD99L2^-淋巴瘤细胞亚系中CXCL16的表达及意义

目的探讨趋化因子CXCL16在淋巴瘤细胞亚系(L428-CD99+和A20-mCD99L2-)中的表达,为深入研究CD99/mCD99L2基因对淋巴瘤细胞趋化因子的影响提供依据。方法分别提取各组细胞总RNA和蛋白,收集无血清培养细胞上清,应用QPCR、Western blot法和ELISA法分别检测各细胞组中CXCL16的表达并比较差异。结果 CXCL16 mRNA在L428-CD99+细胞中的表达低于对照组,在A20-mCD99L2-细胞中的表达高于对照组(P<0.05)。CXCL16总蛋白在L428-CD99+细胞中表达低于对照组,在A20-mCD99L2-细胞中表达高于对照组。ELISA法检测分泌型蛋白在L428-CD99+细胞中表达低于对照组,在A20-mCD99L2-细胞中表达高于对照组(P<0.05)。结论两组淋巴瘤细胞亚系中CXCL16表达与CD99/mCD99L2基因表达呈负相关,提示CD99/mCD99L2基因表达的变化可能影响淋巴瘤细胞该趋化因子的表达。

LAT和CD99在T淋巴母细胞淋巴瘤中的表达及意义

目的探讨LAT和CD99在T淋巴母细胞淋巴瘤(precursor T lymphoblastic lymphoma,T-LBL)中表达的价值。方法对37例T-LBL应用免疫组织化学EnVision二步法进行LAT和CD99标记。同时选取15例其他病例作为对照:3例B淋巴母细胞淋巴瘤,4例非特殊类型外周T细胞淋巴瘤,3例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤,5例淋巴结反应性增生。结果37例T-LBL均表达LAT和CD99;4例外周T细胞淋巴瘤及3例鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤弥漫表达LAT,不表达CD99;3例B淋巴母细胞淋巴瘤均表达CD99,但不表达LAT;5例反应性增生淋巴结的T细胞区LAT阳性,淋巴结皮、髓质区均不表达CD99。结论联合检测LAT和CD99有助于T-LBL的诊断和鉴别诊断。

mic2/CD99在经典型霍奇金淋巴瘤H/RS细胞中的表达及与Eber-1/LMP-1相关性的研究

目的:检测mic2基因与CD99蛋白和Eber-1基因与潜伏膜蛋白-1(LMP1)在经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)H/RS细胞中的表达,探讨mic2/CD99表达与Eber-1/LMP-1的相关性。方法:采用分子原位杂交和免疫组化技术并结合组织芯片技术检测59例石蜡包埋淋巴瘤组织标本[43例cHL,16例非霍奇金淋巴瘤(NHL)]mic2/CD99和Eber-1/LMP-1的表达,比较分析mic2/CD99在两组中的表达及与Eber-1/LMP-1的关系。结果:cHL组CD99蛋白表达阳性率为2·3%,mic2基因表达为55·8%,LMP1表达为58·1%,Eber-1表达为53·5%;NHL组CD99蛋白与mic2基因表达高于cHL组(P<0·05);LMP1和Eber-1的表达低于cHL组(P<0·05);mic2基因的表达高于CD99蛋白的表达(P<0·05);Eber-1与LMP1的表达无统计学意义(P>0·05)。CD99蛋白与LMP1的表达呈负相关(P<0·05),各项指标的表达与性别无关。CD99蛋白与LMP1的表达与年龄呈负相关(P<0·05),mic2与Eber-1的表达与年龄无关(P>0·05)。结论:CD99蛋白在cHL H/RS细胞中低表达,并与LMP1的表达呈负相关。

霍奇金淋巴瘤CD99基因表达缺失的意义

目的 :探讨经典型霍奇金淋巴瘤 (cHL)R S细胞CD99蛋白表达情况 .方法 :将 8例cHL全部按WHO新分类标准进行确诊 ,采用免疫组织化学SABC法进行CD99染色 ,观察每一病例R S细胞阳性表达率 ;流式细胞仪检测B淋巴瘤DG75细胞株 ,T淋巴瘤Jurkat细胞株 ,霍奇金淋巴瘤L4 2 8,HDLM 2细胞株CD99蛋白表达情况 .结果 :8例cHL中R S细胞CD99阴性表达率为 10 0 % (8/8) ;DG75细胞株CD99表达阳性 (87.3± 0 .4 ) % ,Jurkat细胞株CD99表达阳性(96 .8± 0 .6 ) % ,L4 2 8细胞株CD99表达阳性 (3.8± 0 .4 ) % ,HDLM 2细胞株CD99表达 (6 6 .4± 0 .3) %阳性 .结论 :CD99基因在霍奇金淋巴瘤表达缺失可作为诊断cHL的参考依据 .

CD99调控经典霍奇金淋巴瘤细胞株L428向B细胞方向分化

目的分析上调CD99基因对经典霍奇金淋巴瘤(cHL)细胞株L428形态和免疫表型的影响,探究CD99基因对H/RS细胞发生发展的意义。方法鬼笔环肽染色和大细胞计数分析过表达CD99基因对L428细胞形态的影响;免疫细胞化学和流式细胞检测分析上调CD99基因对L428细胞免疫表型的改变。结果 CD99基因的过表达导致L428细胞变小、骨架发生重建,丢失了cHL的诊断标记CD30和CD15,重现B细胞表型PAX5、CD19、CD79α、BCL-6和CD10。结论 CD99基因过表达调控L428细胞向B细胞方向转化,提示cHL的B细胞表型的缺失很可能是CD99基因下调的结果。

α-抑制素CD99联合应用在卵巢性索间质肿瘤表达意义的研究

目的 :探讨α -抑制素、CD99、EMA在卵巢性索间质肿瘤中的表达情况及在该类肿瘤的诊断、鉴别诊断及预后等方面的意义 ,为临床病理诊断和鉴别诊断提供科学依据。方法 :收集我院病理确诊的卵巢性索间质肿瘤 4 1例 ,其中颗粒细胞瘤 2 1例 ,卵泡膜纤维瘤 11例 ,环状小管性索瘤 4例 ,支持间质细胞瘤 3例 ,卵巢支持细胞瘤 2例。同时选择 10例卵巢上皮性肿瘤作为对照进行对比观察(见附表 )。所有标本均经中性福尔马林固定 ,4um切片 ,用SP法免疫组化标记 ,α -抑制素、CD99、EMA均为鼠抗单克隆抗体。DAB显色后 ,苏木素复染、中性树胶封固。以正常一抗动物血清代替一抗做阴性对照 ,抗体由北京中山生物技术公司提供。结果判定 :α -抑制素阳性在核或浆 ,CD99阳性表达在细胞膜或浆。结果 :颗粒细胞瘤 2 1例中 ,α -抑制素 19例阳性 ,阳性率为 90 .5 % ,CD99有 17例阳性 ,阳性率 80 .9% ;卵泡膜纤维瘤 11例中 ,α -抑制素 9例阳性 ,CD99均为阳性 ;环状小管性索瘤4例 ,α -抑制素均为阳性 ,CD993例阳性 ;支持间质细胞瘤 3例、支持细胞腺瘤 2例 ,α -抑制素、CD99均为阳性 ,幼年性颗粒细胞瘤复发者 1例两次均为阳性。结论 :α -抑制素、CD99联合应用标记性索间质肿瘤有很高的敏感性和特异性 ,对区分性索间质肿瘤类型、

肾透明细胞癌转移相关的CD99选择性剪接异构体的筛选

目的:寻找人肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中CD99转移相关选择性剪接异构体,探讨CD99选择性剪接异构体表达与ccRCC转移的关系。方法:通过选择性剪接数据库(alternative splicing database,ASD)对CD99基因可能存在的选择性剪接异构体进行预测。运用自行设计的5对特异性引物,采用RT-PCR技术,在转移组织、发生及未发生转移的癌组织、癌旁组织的各混合样本中检测6种预测异构体的表达,再对电泳所获条带进行克隆、测序。在各个组织样本中检测CD99Ⅰ、CD99Ⅱ和新型CD99选择性剪接异构体(CD99-Ⅲ)的表达。结果:从6种预测异构体中筛选出一种新型异构体(CD99-Ⅲ)。该异构体在转移组织中表达率(8/9)高于未发生转移的原发癌组织(10/21,P<0.05)。CD99Ⅰ型在样本中均表达,CD99Ⅱ型在发生转移的原位癌组织中表达率(6/9)远高于未转移的原发癌组织(3/21,P=0.008)。结论:CD99-Ⅲ为一种新型选择性剪接异构体,且CD99Ⅱ型、CD99-Ⅲ的表达可能与ccRCC的转移进展有关。

CD99基因转染对霍奇金淋巴瘤L428细胞株表型、细胞周期与凋亡的影响

目的:观察CD99基因转染对霍奇金淋巴瘤L428细胞株表型、细胞周期与凋亡的影响。方法:L428细胞分为3组:转染CD99基因组、转染空质粒组及空白对照组。采用免疫细胞化学方法检测3组细胞CD15、CD30与CD99的表达,并用流式细胞术分别检测细胞周期和细胞凋亡。结果:与其他2组相比,转染CD99基因组L428细胞CD15、CD30表达消失,但可检测到CD99的表达。3组细胞周期分布存在差异,转染CD99基因组细胞阻滞于G2/M期(F=24.85,P<0.001)。3组细胞凋亡率相比,差异有统计学意义(F=45.30,P<0.001),其中转染CD99基因组细胞凋亡率为(12.7±4.6)%,高于转染空质粒组的(4.0±0.9)%和空白对照组的(3.6±1.6)%(P<0.05)。结论:CD99基因可能在霍奇金淋巴瘤的发生中起重要作用。

mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428细胞株中表达

目的克隆mic2/CD99基因并表达于L428细胞株。方法通过PCR及双酶切方法,从Jurkat细胞基因组RNA中获得mic2/CD99全长基因编码序列,克隆到pcDNA3.1(+)质粒载体上,构建包含mic2/CD99全长基因载体;用脂质体转染法将mic2/CD99全长基因载体转染至L428细胞系;并从分子水平验证其存在。结果RT-PCR方法扩增出大小为558bp片段,序列测定其编码序列正确,酶切鉴定亚克隆序列正确。结论成功构建了mic2/CD99全长基因载体,并稳定转染于L428细胞株中。

细胞黏附分子CD99与肿瘤关系的研究进展

CD99分子是细胞黏附分子的一种,参与细胞黏附、凋亡过程及肿瘤细胞的迁移、浸润、侵袭,在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用。与正常组织相比,某些肿瘤中CD99出现异常表达,这对于肿瘤的鉴别诊断、转移潜能判断、治疗和预后估计等方面有潜在的应用价值。

地高辛标记斑马鱼cd99l2基因RNA探针的制备

目的制备用于斑马鱼胚胎早期cd99l2基因时空表达检测的地高辛标记RNA探针。方法设计引物,构建cd99l2/pGM-T重组质粒,用SacII和SalI分别进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6RNA聚合酶和T7RNA聚合酶转录合成地反义和正义地高辛标记的RNA探针,用整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的表达。结果成功构建了cd99l2/pGM-T重组质粒,体外转录获得反义和正义RNA探针,反义探针杂交检测证实cd99l2基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中中枢神经系统呈现高表达,正义探针未检测到表达信号。结论本研究制备的反义cd99l2RNA探针,兼顾了特异性和敏感性,能有效检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的定位表达,而正义探针可以作为阴性对照,为进一步探究cd99l2基因在斑马鱼发育过程中的作用机制奠定了基础。

CD99阳性的间叶性软骨肉瘤5例并文献复习

目的 分析间叶性软骨肉瘤的病理形态学、诊断及鉴别诊断。方法 报道 5例间叶性软骨肉瘤 ,从病理组织学、免疫组化等方面进行观察。结果 5例间叶性软骨肉瘤 3例位于上腭 ,1例位于右枕顶叶 ,另 1例位于左臀肌内。肿瘤大体呈鱼肉状 ,并混有质硬的软骨、碎骨或钙化组织。组织学由血管外皮瘤样构型的原始未分化小细胞和相对成熟透明的软骨小岛构成。免疫组化未分化小细胞呈不同程度CD99膜阳性 ,Vim弱阳性 ;S 10 0局限于软骨陷窝内软骨细胞或软骨母细胞。结论 此病在未分化小细胞区找到相对成熟的软骨组织是诊断要点 。

低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系的建立及鉴定

目的:建立和鉴定稳定的低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系,以探究mCD99L2基因在Hodgkin′s淋巴瘤H/RS细胞形成中的作用。方法:对前期构建的慢病毒质粒稳定干扰的A20-LV-mCD99L2克隆株进行体外培养,分别选择第10、20、30、40代细胞,DNA-PCR检测shRNA干扰载体的整合,RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2的表达水平,倒置显微镜观察A20-LV-mCD99L2细胞的形态变化并进行计数,免疫荧光观察H/RS样大细胞mCD30分子的表达。结果:第10、20、30、40代A20-LV-mCD99L2细胞(1)抽提DNA进行PCR均能检测出shRNA干扰载体稳定整合至A20细胞基因组;(2)RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2均较A20细胞呈低水平表达;(3)各代A20-LV-mCD99L2细胞中均发现有类似人H/RS细胞的大细胞(A20-H/RS);(4)免疫荧光检测H/RS样细胞mCD30呈阳性表达。结论:鉴定和建立了低表达mCD99L2基因的A20细胞亚系,该细胞亚系中存在类似人H/RS细胞的大细胞。

原发性肾透明细胞癌中转移相关基因CD99、FKBP5和FLJ13576的表达

目的:探讨肿瘤转移相关分子CD99、FKBP5、FLJ13576在原发性肾透明细胞癌中的表达。方法:应用半定量RT-PCR技术研究肿瘤转移相关分子CD99、FKBP5、FLJ13576在肾透明细胞癌组织和癌旁组织中的差异性表达。结果:CD99、FKBP5、FLJ13576在原发性肾透明细胞癌组织中的表达率分别为72%、60%和48%,而对应癌旁组织中的表达率分别为28%、24%和16%,表达水平也明显不同。肾透明细胞癌组织中CD99、FKBP5和FLJ13576 3种基因的表达水平均显著高于癌周组织(P<0.05)。结论:肿瘤转移相关分子CD99、FKBP5、FLJ13576在肾透明细胞癌原发组织中的表达明显上调,可能与肾细胞癌发生、发展密切相关,有望成为检测肾细胞癌的新的生物学标志。

CD99在部分骨及软组织小细胞恶性肿瘤中的表达及意义

目的观察CD99在部分小细胞恶性肿瘤中的表达及意义。方法对257例骨和软组织小细胞恶性肿瘤采用EnVision二步法检测CD99的表达。结果257例中CD99在间叶性软骨肉瘤的阳性率为93.3%(14/15),在骨内EWS及软组织内EWS/PNET的阳性率为100%(97/97);在浆细胞骨髓瘤的阳性率为2.7%(2/73);在骨内原发性恶性淋巴瘤(均为B细胞型非霍奇金淋巴瘤)的阳性率为13.5%(5/37);在小细胞型骨肉瘤的阳性率为95%(17/18);在骨转移性小细胞癌的阳性率为70%(7/10);在以梭形细胞为主的单向型滑膜肉瘤的阳性率为100%(5/5);1例促结缔组织增生性小细胞肿瘤为(+);而1例软组织胚胎性横纹肌肉瘤为(-)。结论CD99可在多种小细胞恶性肿瘤中有阳性表达。此抗体在骨及软组织小细胞恶性肿瘤的鉴别诊断中特异性较差,CD99单项阳性不能作为鉴别诊断依据。

BCL-6在经典型霍奇金淋巴瘤细胞株L428和过表达CD99的L428中的表达差异及其意义

目的:探究BCL-6在经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin's lymphoma,cHL)细胞株LA28和过表达CD99的LA28(L428-CD99^+)中的表达差异及其意义。方法:应用免疫细胞化学和免疫荧光共聚焦检测BCL-6和CD99在cHL细胞株LA28和LA28-CD99^+中的表达;运用实时荧光定量PCR和Western blotting检测细胞株LA28和LA28-CD99^+中BCL-6和CD99的表达水平;MTT实验检测LA28和L428-CD99^+细胞增殖能力的差异;流式细胞术检测L428和LA28-CD99^+细胞的凋亡差异。结果:免疫细胞化学和免疫荧光共聚焦显示CD99在LA28细胞中为阴性表达,在L428-CD99^+细胞中为阳性表达,并定位于细胞膜;BCL-6在LA28细胞为阴性表达,在LA28-CD99^+细胞株中为阳性表达,并定位于细胞核。Western blotting显示CD99和BCL-6在LA28细胞为阴性表达,在LA28-CD99^+细胞为阳性表达。实时荧光定量PCR结果显示,与L428细胞相比,CD99和BCL-6 mRNA在LA28-CD99^+细胞中的表达量增高(P<0.01)。MTT显示LA28细胞增殖能力强于L428-CD99^+细胞(P<0.01);流式细胞术显示L428-CD99^+细胞凋亡较LA28细胞增多(P<0.01)。结论:过表达CD99诱发BCL-6表达增高,可导致L428细胞增殖能力下降及凋亡增加。

CD99在隆突性皮肤纤维肉瘤中的表达及其意义

目的:观察隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)及皮肤纤维瘤(DF)中CD99的表达情况并探讨其意义。方法:通过免疫组织化学染色方法检测28例DFSP、10例DF中CD99蛋白表达情况,并结合CD34等前期研究结果进行综合分析。结果:CD99蛋白在DFSP(75%)中阳性表达率要明显高于DF(10%),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:CD99可做为鉴别DFSP和DF的重要分子,其在DFSP中的高表达可能与肿瘤细胞的侵袭性密切相关,并提示DFSP肿瘤细胞可能来源于原始神经外胚层细胞。

CD99蛋白在胃腺癌组织中的表达及其临床意义

[目的]探讨CD 99蛋白表达在胃腺癌诊断中的意义.[方法]采用免疫组织化学方法给111例胃腺癌和20例正常胃黏膜组织进行CD 99蛋白表达检测.[结果]CD 99蛋白在正常胃黏膜细胞中呈高度表达,在胃腺癌细胞中呈低度表达,在正常胃黏膜和胃腺癌组织免疫组织化学染色积分数分别为7.92±3.14,1.85±3.05,两者间有显著性差异.CD 99蛋白在早期胃癌组织中的表达高于进展期,且进展期Ⅰ期病变中的积分数高于进展期Ⅳ期.[结论]CD 99蛋白的免疫组织化学检测可作为胃腺癌早期诊断的参考指标.