CDAP活化制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液的稳定性试验

目的：评价以1－氰基－4－二甲氨基－吡啶四氟硼酸（ CDAP ）活化制备的C群脑膜炎球菌结合疫苗原液的稳定性。方法以变通的现有工艺为基础，选取C群脑膜炎球菌结合疫苗原液连续3批样品，分别放置于（37＆#177;2）℃、（25＆#177;2）℃，和2～8℃三种温度下，根据稳定性试验原则定期取样并进行主要指标的检测，评估原液的稳定性。结果 C群脑膜炎球菌结合疫苗原液于2～8℃保存18个月，（25＆#177;2）℃保存20周，37℃保存7天，各项检测指标均符合质量标准的要求。结论在2～8℃之下，施行变通的工艺， C群脑膜炎球菌结合疫苗原液可稳定存放18个月。

疫苗中残余CDAP检测方法的建立

为了对多糖活化剂———1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)的残余水平进行有效监控,本研究建立了基于高效阳离子交换层析的简便易行的检测方法,进行验证后的结果表明,该法具有良好的专属性、准确度、精密度,检出限可低至16μg/L,在20～100μg/L的范围内具有良好的线性。

Hib多糖衍生物中残余CDAP检测方法的建立

目的在b型流感嗜血杆菌结合疫苗生产过程中有效监控1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)的残留量。方法在已有针对流脑多糖衍生物的基于强阳离子交换层析检测法的基础上进行改进。结果该法具有良好的专属性、准确度、精密度,最低检出限为6μg/L,且在20~100μg/L的范围内线性良好。结论建立了一种针对b型流感嗜血杆菌多糖衍生物中CDAP的检测方法。

CDAP活化多糖制备5型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗

目的用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)代替溴化氰(CNBr)活化5型肺炎链球菌荚膜多糖,制备5型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(TT)结合疫苗。方法将5型肺炎链球菌荚膜多糖溶液加CDAP活化,经ADH和缩合剂EDAC与破伤风类毒素进行偶联,经凝胶过滤柱层析纯化,得到5型肺炎链球菌多糖-TT结合物,并对其生化指标、血清学特异性、安全性及免疫原性进行检测。结果多糖-TT结合物的游离多糖含量与多糖的衍化率成反比;血清学特异性良好;经动物实验证明其安全性合格;具有良好的免疫原性,且游离多糖含量越低,免疫原性越强。结论用CDAP活化工艺制备的5型肺炎链球菌荚膜多糖-TT结合物适宜制备疫苗。

多糖结合疫苗中残余CDAP检测方法的建立及验证

目的建立测定多糖结合疫苗中残余1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC),为多糖结合疫苗的质量监控提供依据。方法 HPLC色谱条件:色谱柱:TSK gel ODS-100V(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈-水-三氟乙酸(60∶40∶0.1);检测波长:300 nm;流速:1 ml/min;进样体积:15μl;理论塔板数按CDAP峰面积计算不低于2 000。以峰面积对浓度进行线性回归,确定该方法的线性范围,并对该方法进行专属性、检测限、定量限、精密度、稳定性及准确度验证。结果该方法检测CDAP专属性良好,最低检测限和定量限分别为35 ng/ml和40 ng/ml;CDAP浓度在160~4 000 ng/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R^2=0.999 9;供试品和CDAP标准品连续6次进样,RSD分别为0.26%、0.57%;供试品在8 h内稳定,平均加样回收率为94.5%,RSD为2.5%。结论建立了测定多糖结合疫苗中残余CDAP含量的HPLC测定方法,该方法准确、简便、可靠,能有效控制多糖结合疫苗的质量。

海洋真菌多糖YCP多克隆抗体的制备和鉴定

多糖YCP经CDAP活化与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备了质量比(WBSA/WYCP)为0.15的拟糖蛋白(YCP-BSA),用该拟糖蛋白免疫新西兰大白兔,制备了抗YCP的抗血清,采用辛酸-硫酸铵法纯化,间接ELISA测定,获得了效价为1∶20 000的YCP多克隆抗体。

人血清中Hib荚膜多糖抗体定量的ELISA方法建立及初步验证

目的比较两种不同活化方法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-Ty)的特性,分别作为包被抗原建立测定人血清中Hib荚膜多糖特异抗体含量的ELISA方法。比较并确定包被抗原,对建立的ELISA方法进行初步验证。方法分别用CNBr和CDAP作为活化剂制备PRP-Ty,经Sepharose CL-4B层析分析相对分子质量分布范围,并确定适宜PRP-Ty抗原包被浓度的间接ELISA方法,以人Hib荚膜多糖IgG抗体定量标准品作为阳性标准,通过四参数非线性拟合计算人血清Hib荚膜多糖IgG抗体含量。结果 CNBr活化法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-TyCNBr)较天然Hib荚膜多糖相对分子质量向小相对分子质量方向偏移,而CDAP活化法制备的酪胺化Hib荚膜多糖(PRP-TyC DAP)较天然Hib荚膜多糖相对分子质量分布无显著变化;两种PRP-Ty在0.65～2.00μg/mL的包被浓度范围内均有良好的包被活性,方法的灵敏度均达到0.02μg/mL IgG抗体检测水平。结论 PRP-TyC DAP作为包被物的ELISA测定方法可以更加真实可靠地反映人血清IgG抗体水平。

化学切割重组融合蛋白制备人胸腺肽β_4

目的:在大肠杆菌中表达人胸腺肽β4(Tβ4)的融合蛋白,通过CDAP介导的化学切割将融合部分切除,获得人Tβ4。方法:分别以质粒pET-Tβ4和pET-L12为模板,扩增Tβ4和核糖体亚基蛋白L12的基因片段,再以这2段基因为模板进行重叠PCR,并在连接处引入一个半胱氨酸(Cys)密码子,将得到的融合蛋白Tβ4-Cys-L12基因片段与pET-22b载体连接,构建表达质粒,将其与N-末端乙酰转移酶质粒共转化至大肠杆菌BL21(DE3)并共表达,获得N端乙酰化修饰的融合蛋白Tβ4-Cys-L12;利用CDAP氰基化Cys的巯基,于pH10.0条件下在Cys残基N端完成切割,分离纯化获得Tβ4。结果:质谱分析目的产物相对分子质量为4962.70,与天然Tβ4一致,表明获得了Tβ4。结论:CDAP介导的化学法可以有效切割融合蛋白获得Tβ4,建立了一套Tβ4的生物制备方法。

中间件在税务信息化中的应用

针对中国税务信息化建设过程中存在的问题,以及对中间件的特点、在税务信息化中应用中间件技术的好处、可行性等的分析,提出了应用中间件CDAP进行解决的思路及一种基于该中间件CDAP的税务信息化系统体系结构,并对其参数进行了适当的优化与调整。不但提高了系统的并发处理能力和效率,而且较好地解决了数据完整性和安全性等问题。

DCAP3000分散式变电站综合自动化系统的应用

本文介绍了DCAP30 0 0分散式变电站综合自动化系统的组成、结构和功能特点 ,以及DCAP30 0

1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼活化A群脑膜炎球菌多糖制备的结合疫苗的免疫原性及其工艺稳定性

目的分析1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化A群脑膜炎球菌多糖(group A meningococcal polysaccharide,Men APS)制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫原性及其工艺稳定性。方法用CDAP活化多糖后,己二酰肼(adipic dihydrazide,ADH)衍化,制备多糖-酰肼基衍生物,在碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopmpyl)carbodiimide,EDAC]作用下,与TT偶联,制备A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液(Men APSCDAP-TT),考察其免疫特性;将Men A PSCDAP-TT与C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液混合,制备A、C群脑膜炎球菌结合疫苗(Men ACPSCDAP-TT),再与市售的采用溴化氰(CNBr)活化多糖制备的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗(Men ACPSCNBr-TT)进行抗A群多糖Ig G抗体水平的比较。连续制备12批结合疫苗原液及9批结合疫苗,原液参考《中国药典》三部(2010版)进行各项检定,疫苗进行抗A群多糖Ig G抗体水平的检测。结果 Men APSCDAP-TT具有T细胞依赖性抗原特性;Men ACPSCDAP-TT免疫2次后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT明显高于市售疫苗免疫2次后水平,差异有统计学意义(P均<0.01),也高于或相似于市售疫苗免疫3次后水平,但差异无统计学意义(P均>0.05);免疫3次后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT仍高于或相似于市售疫苗,但差异无统计学意义(P>0.05)。连续制备的12批结合疫苗原液,内毒素含量均低于10 EU/μg多糖,未检出游离蛋白,多糖/蛋白值、结合多糖含量、结合物分子大小分布、EDAC和ADH残留均符合A群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程(试行)YBS01112006的要求,主要检测指标及多糖回收率趋势分析基本在均数±2标准差内;9批Men ACPSCDAP-TT免疫后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT均在A群脑膜炎球菌多糖的60倍以上。结论经CDAP活化多糖后衍化再与载体蛋白结合制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗具有良好的免疫原性,制备工艺稳定、可靠,为规模化生产奠定了基础。

不同功能基团对3型肺炎球菌荚膜多糖免疫原性影响的初步研究

目的比较3型肺炎链球菌荚膜多糖不同基团活化对多糖抗原性及结合物免疫原性的影响。方法分别采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化多糖羟基,碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)活化多糖羧基,再与己二酰肼(adipic dihydrazide,ADH)偶联获得活化度相近的多糖衍生物。用三硝基苯磺酸方法(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)测定多糖活化度;高效液相分子排阻与多角度激光散射仪联用(HPLC-SEC-MALLS)分析衍生物分子分布和大小;Zeta电位仪与滴定仪联用分析其表面电荷变化;速率比浊法和免疫双扩散法比较其抗原性变化;利用多糖衍生物与载体蛋白偶联获得的不同结合物免疫小鼠,间接ELISA分析不同结合物免疫后的IgG抗体浓度,进一步阐述活化过程中多糖抗原性的变化对结合物免疫原性的影响。结果TNBS结果显示,获得同一基团不同活化度(5%~30%)、不同基团(羟基和羧基)活化度相近的多糖衍生物;等电点分析结果显示,不同基团的活化会导致多糖表面不同的电荷变化;而速率比浊和免疫双扩散的结果显示,多糖羟基的活化会导致多糖抗原性略有下降,但不同活化度之间差异较小;在相似活化度情况下,羧基衍化物的抗原性更低,随着羧基活化度的增加,多糖抗原性下降明显(约60%)。小鼠ELISA结果显示,对羧基不同程度活化得到的结合物,其免疫原性较多糖明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05);随着多糖羧基活化度的增加,结合物免疫原性先增加后降低。结论3型多糖重复单位上的羧基的改变对抗原性影响较羟基更大,对羧基的过度活化会影响结合物的免疫原性。

22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化及其多糖蛋白结合物的免疫原性

目的用不同活化剂进行22F型肺炎球菌荚膜多糖(type 22F streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide)的活化,并探讨其多糖蛋白结合物的免疫原性。方法分别用溴化氰(cyanogen bromide,CNBr)和1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)作为22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化剂,1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为链接剂,制备22F型肺炎荚膜多糖衍生物(3批Pn22FpsADH1和3批Pn22Fps-ADH2);在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的作用下,将衍生物与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)共价结合,经凝胶过滤柱层析纯化,得到22F型肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物(3批Pn22Fps-TT1和3批Pn22Fps-TT2);并对其生化指标、血清学特异性、免疫原性及异常毒性进行检测。结果衍生物Pn22Fps-ADH2的衍生率及回收率均略高于Pn22Fps-ADH1;结合物Pn22Fps-TT2的生化指标检测结果相对Pn22Fps-TT1较好;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均可与22F型肺炎球菌诊断血清特异性结合;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均具有良好的免疫原性;无异常毒性。结论 CNBr和CDAP均可作为22F型肺炎球菌荚膜多糖活化剂,经活化和结合反应,其抗原位点得到较好保留,但CDAP作为结合疫苗多糖的活化试剂效果更佳。

多糖活化剂1-氰基,4-2甲氨基吡啶四氟硼酸盐降解产物的结构分析

目的分析多糖活化剂1-氰基,4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino-pyridinium,CDAP)降解产物的结构。方法将CDAP用重水(pH 9.0)进行过夜降解,采用紫外光谱(200~400 nm)、一维核磁氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)分析CDAP降解前后的结构变化,并通过外标法计算降解程度。结果 CDAP在碱性环境中过夜降解后,其产物与4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)一致,降解程度达99.5%以上。结论 CDMP降解的主要产物为DMAP,应将DMAP残留纳入基于CDAP活化的多糖-蛋白结合疫苗生产过程中质量控制指标。