Cdc2相关蛋白激酶PFTK1单克隆抗体的制备

本试验以Cdc2相关蛋白激酶PFTK1的120～141位多肽段与载体蛋白KLH偶联制备人工抗原,免疫Balb/c小鼠,取高免疫效价的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在PEG4000作用下进行融合,通过有限稀释法最终得到了2株分泌抗PFTK1抗体的杂交瘤细胞,分别命名为4E7和2E3,经鉴定2株抗体均为IgM亚型,轻链均为κ型。经过Western blotting鉴定该抗体能够与PFTK1(1～139肽段)特异性结合。此抗体经过优球蛋白沉淀法纯化后,其纯度达到86.8%。该抗体的制备为研究蛋白激酶PFTK1功能奠定了基础。

细胞周期蛋白依赖性激酶cdc2与恶性肿瘤发生发展的研究

cdc2在细胞周期调控中起着调控G2至M期的作用。在G2期后期,cyclinB与cdc2结合,形成有丝分裂促进因子(MPF),再由cdc25、cyclin H、cdk7等一些磷酸酶和激酶作用,使其激活,活化的MPF通过cdc2对细胞核内组蛋白H1、核纤维层蛋白A、B、C、核仁蛋白nucleolin等蛋白发生直接或间接磷酸化作用,从而诱导产生一系列变化,使细胞发生有丝分裂。cdc2的过度表达或缺乏,可使细胞周期进程发生紊乱,不能正常生长、分化。cdc2过表达往往导致细胞恶性增殖,形成肿瘤。现已证明cdc2过度表达与许多恶性肿瘤的发生、发展、预后有关,但与神经干细胞、胶质瘤干细胞之间的关系尚待阐明。

CDC28蛋白激酶调节亚基2对卵巢癌A2780细胞丝足形成的影响及其机制研究

目的探讨CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)对A2780细胞丝足形成的影响及其可能机制。方法采用慢病毒介导的sh RNA敲除A2780细胞的CKS2基因,显微镜下观察细胞丝足的变化;采用细胞划痕实验检测A2780细胞迁移能力的变化;采用real time PCR检测CKS2敲除对CDC42两种剪接变异体(CDC42-V1和CDC42-V2)表达的影响,以及不同卵巢癌标本中CKS2、CDC42-V1和CDC42-V2剪接变异体的表达情况。结果 CKS2表达抑制后,A2780细胞丝足明显减少,细胞迁移能力明显减弱(P<0.05),CDC42-V1 m RNA表达降低,而CDC42-V2 m RNA表达升高(P<0.05)。Real time PCR结果显示,卵巢癌组织标本中CKS2及CDC42-V1的表达高于对应的正常卵巢组织,而CDC42-V2的表达低于对应的正常卵巢组织(P<0.05)。结论 CKS2通过调控CDC42的选择性剪接而影响细胞丝足的形成,进而影响卵巢癌细胞A2780的迁移能力。

舌鳞癌中p34cdc2与cyclin B1的表达及相关研究

目的研究舌鳞癌组织中p34cdc2与cyclin B1蛋白的表达,探讨它们阳性表达的相关性及其与舌鳞癌临床病理特征的关系。方法随机收集舌鳞癌标本60例,对照上皮包括正常舌组织11例、癌旁组织49例。采用免疫组织化学SP法显示p34cdc2与cyclin B1蛋白的表达,并结合舌鳞癌的临床病理特征进行分析。结果舌癌组织中可见p34cdc2与cyclin B1蛋白表达并显棕色/黄色,主要定位于细胞浆中。两种蛋白在癌组织中存在增多表达,与正常组织和(或)癌旁组织中的表达差异有显著性(P<0.01)。p34cdc2蛋白的表达在舌鳞癌不同临床分期、组织分级和有无淋巴结转移组间差异有显著性(P<0.05),而与年龄、性别无统计学意义;同时cyclin B1蛋白的表达也在舌鳞癌不同临床分期、组织分级中差异有显著性(P<0.05),而在不同年龄、性别及有无淋巴结转移组间差异无显著性。结论p34cdc2及cyclin B1蛋白在舌鳞癌中有表达增多现象,或许可反映舌鳞癌细胞分裂增殖能力;增多表达的p34cdc2及cyclin B1蛋白可作为评价舌鳞癌临床分期和组织分级等临床病理特征的参考指标之一。

三氧化二砷抑制cdc2基因表达诱导K562白血病细胞G_2/M周期停滞

目的检测三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)诱导慢性髓系白血病急变细胞K562周期停滞中细胞周期相关调节基因的转录、蛋白表达及其磷酸化改变,以期阐明As2O3诱导其周期停滞的分子生物学机制,为克服K562细胞的As2O3抵抗性提供实验基础。方法体外培养K562细胞,采用PI染色、流式细胞仪检测As2O3作用后细胞周期分布的改变;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞周期相关调节基因mRNA表达变化;Westernblot检测相关蛋白及磷酸化改变。结果As2O3作用K562细胞24h后,G2/M期细胞比例明显增加,浓度为0、2、5、10μmol/L时G2/M期细胞比例分别为(22.6±3.4)%、(27.2±2.3)%、(43.8±4.5)%、(36.7±4.1)%;K562细胞在As2O3处理前有Sur-vivin、cdc2、chk1基因表达,As2O3处理后Survivin、chk1的表达无明显变化,但cdc2表达呈浓度依赖性下调;As2O3作用前可见Survivin、cdc2、cdc2-p、chk1等4种蛋白的表达,作用24h后,Survivin的表达条带增强,cdc2蛋白表达水平呈浓度依赖性下调,cdc2-p水平在2～5μmol/L时无明显变化,在10μmol/L时受抑明显,chk1蛋白表达水平在As2O3作用前后无明显改变。结论As2O3显著诱导K562白血病细胞G2/M周期停滞,其机制与抑制cdc2转录水平,下调活性化cdc2蛋白表达有关。不能有效抑制抗凋亡蛋白Survivin的表达可能是K562白血病细胞对As2O3诱导凋亡抵抗的一个重要机制。

Cdc2基因敲低逆转录病毒载体设计与构建方法

目的设计和构建cdc2基因敲低的表达siRNA的逆转录病毒重组载体。方法利用在线软件siRNASelectionProgram和siDirect设计干扰cdc2基因靶序列,合成回文DNA序列,退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体扩增、抽提后行双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞,产生逆转录病毒,并利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果pSUPER表达siRNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入的60bp序列与原序列一致,位置正确。pSUPER.retro-C1、pSUPER.retro-C2病毒滴度值分别为4.25×105CFU/ml和6.00×105CFU/ml。结论cdc2基因表达siRNA逆转录病毒重组载体构建成功,可为研究胶质瘤分子病因学提供有用工具。

青蒿琥酯引起骨髓瘤细胞RPMI8226 G_2/M期阻滞

目的研究青蒿琥酯对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞周期的影响及可能机制。方法分别以浓度为0、25、50μg/mL的青蒿琥酯作用于RPMI8226细胞,用透射电镜观察细胞变化,流式细胞术检测细胞周期分布,蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclin B1和p34cdc2的变化。结果 50μg/mL青蒿琥酯处理48h后,多数细胞显示出凋亡细胞的特征性形态。随着青蒿琥酯浓度增加,G0/G1期细胞的比例逐渐下降(P<0.05),G2/M期细胞的比例逐渐上升(P<0.05),细胞明显阻滞于G2/M期。细胞周期蛋白cyclin B1表达水平随青蒿琥酯浓度的增加而增加,p34cdc2表达水平随青蒿琥酯浓度的增加而降低。结论青蒿琥酯能将RPMI8226细胞阻滞于G2/M期,其机制可能与cyclin B1的升高及p34cdc2的降低有关。

肝再生增强因子对细胞周期素依赖性激酶1基因表达的影响

目的研究人肝再生增强因子(ALR)对细胞周期素依赖性激酶1启动子(CDK1p)转录调节的作用,探讨ALR的生物学作用机制。方法根据GenBank中CDK1p序列的分析设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)扩增人CDK1基因启动子基因序列,并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建CDK1启动子报告基因表达载体pCAT3-CDK1p,以该质粒转染HepG2细胞系,并同时与pcDNA3.1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果 pCAT3-CDK1p组CAT表达活性明显高于pCAT3-basic组,差异有统计学意义,pCAT3-CDK1p与pcDNA3.1(-)-ALR共转染组的CAT表达活性明显低于pCAT3-CDK1p组,差异有统计学意义。结论 CDK1启动子有顺式激活下游基因的活性,ALR对CDK1基因有下调作用。

以CDC2激酶为靶点的反义基因治疗大鼠慢性增生性胆管炎

目的 胆结石的术后高复发率和胆道再狭窄率均与术后遗留的慢性增生性胆管炎（proliferative cholangitis,PC）密切相关,故探讨CDC2 kinase shRNA对PC的抗增殖疗效和抑制成石潜力的可行性意义重大.方法 向大鼠PC模型的胆总管内注入0.5 ml的CDC2 kinase shRNA.数据采用方差分析、q检验.结果 CDC2 kinase shRNA可通过抑制CDC2 kinase,PCNA和Procollagen Ⅰ的表达,有效遏制胆道黏膜上皮、黏膜下腺体和胆管壁胶原纤维的过度增殖,并使内源性β-葡萄糖醛酸酶的分泌减少50%,从而降低PC的成石潜力.结论 CDC2 kinase shRNA对PC的抗增殖疗效可能有助于预防肝内胆管结石的术后复发和胆道再狭窄.

LHRH拮抗剂Cetrorelix对子宫内膜癌细胞生长周期的影响及其机理

目的 :研究LHRH拮抗剂Cetrorelix对子宫内膜癌细胞生长周期及周期相关蛋白的影响 ,探讨其抑制内膜癌细胞生长的机理。方法 :用流式细胞仪细胞周期分析及Westernblotting蛋白分析法 ,研究在Cetrorelix的作用下子宫内膜癌细胞系HEC 1A细胞生长周期及相关周期蛋白的改变。结果 :1 0 -5mol/LCetrorelix可导致HEC 1A细胞生长停滞于G2 /M期 ,而与G2 /M期停滞相关的p5 3 ,磷酸化p5 3 (phospho p5 3 ) (丝氨酸 3 92 )及磷酸化cdc2 (phospho cdc2 ) (酪氨酸 1 5 )蛋白水平均显著增高。结论 :Cetrorelix抑制内膜癌细胞增殖作用的机理是结合细胞表面受体后引起一系列抑制性信号传递 ,导致细胞周期停滞于G2 /M期 ,主要表现为G2 期停滞。其中p5

垂体瘤转化基因、P27及周期素依赖性激酶4在胶质瘤中表达及其相关性研究

目的探讨胶质瘤中垂体瘤转化基因(PTTG)、周期素依赖性激酶抑制因子P27在胶质瘤中的作用以及它们与胶质瘤细胞周期的关系。方法40例胶质瘤标本分为Ⅰ级8例、Ⅱ10例、Ⅲ级13例、Ⅳ级9例,RT-PCR检测PTTG及P27mRNA的表达,免疫组织化学检测PTTG、P27及周期素依赖性激酶4(CDK4)的表达。结果PTTGmRNA在Ⅰ～Ⅳ级的表达分别为(0.907±0.065)、(1.109±0.083)、(1.312±0.089)、(1.499±0.215),组间比较差异有统计学意义(P<0.05或0.01);P27mRNA在Ⅰ～Ⅳ级的表达分别为(1.308±0.117)、(1.105±0.200)、(0.826±0.163)、(0.610±0.063),组间比较差异有统计学意义(P<0.05或0.01);PTTG蛋白及CDK4蛋白表达均随肿瘤病理级别的增高而增加,两者在各组间比较差异有统计学意义(均P<0.05).P27蛋白表达随肿瘤病理级别的增高而降低,组间比较差异有统计学意义(P<0.05);PTTG与CDK4蛋白表达之间呈正相关(P<0.01),与P27蛋白表达之间呈负相关(P<0.01),P27蛋白与CDK4蛋白表达之间呈负相关(P<0.01)。结论PTTG、P27在胶质瘤的发生、发展中起重要的作用,两者的异常表达有细胞周期调控有关。

角蛋白19通过上调CDK1促进乳腺癌细胞增殖和化疗耐受

目的探讨角蛋白19（KRT19）在乳腺癌中的作用及机制。方法用qRT—PCR方法检测35例乳腺癌组织及配对癌旁组织中KRTl9表达量，分析其表达量与乳腺癌TNM分期、分化程度及远端转移等的相关性。同时检测正常乳腺上皮细胞和多种乳腺癌细胞中KRT19基础水平的表达量。在乳腺癌细胞中干预KRT19的表达，检测细胞的增殖能力和克隆形成能力，四唑氮化合物（MTS）实验检测细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性。Western blot技术检测细胞周期相关蛋白的表达。结果KRT19在乳腺癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，且其表达量与乳腺癌TNM分期及远端转移有关，而与乳腺癌组织分化无关。同样的，KRT19在乳腺癌细胞中的表达量也明显高于正常乳腺上皮细胞。在MCF-7细胞中过表达KRT19，能够明显增加该细胞的增殖能力、克隆形成能力及其对5-Fu的化疗耐受性。而在MDA—MB-231细胞中干扰KRT19的表达，得到完全相反的结果。机制研究中发现KRT19可上调CDK1而对p27无作用。结论KRT19在乳腺癌中明显高表达，且与乳腺癌TNM分期及远端转移等临床特征呈正相关。KRT19通过上调CDK1加强乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力以及其对5-Fu的化疗耐受性。

C型Niemann-Pick病神经原纤维缠结的形成与特征

目的探讨C型尼曼-皮克病（NPC）脑部神经原纤维缠结（NFT）形成的时相特征。方法以17例年龄7个月至55岁的NPC患者为研究对象，采用tau蛋白和有丝分裂期相关抗体进行免疫组织化学染色和银染，分析患者脑内NFT形成的特点。结果最早可在4岁的患者海马旁回发现典型的NFT形成，随年龄增长数量逐渐增多。在形态上与阿尔茨海默病（AD）所见高度相似，但未发现老年斑。在NPC中，有丝分裂期磷酸化表位早于tau蛋白过度磷酸化及NFT形成。结论NFT形成并非老龄化过程的结果，且与老年斑的存在与否并无关联。cdc2／cyclinB1可能是NFT形成的关键性早期事件，针对其活性的抑制剂对于早期干预NPC NFT的形成有重要意义。