蛋白激酶A/Cdc25B通路在小鼠卵母细胞G_2期阻滞中作用的研究

目的:研究小鼠卵母细胞G2期阻滞中,蛋白激酶A(PKA)的候选底物及靶位点。方法:将野生型和突变型(S321A)cdc25B克隆至pBluescriptSK载体中,体外转录成mRNA,显微注射到dbcAMP处理和未处理的卵母细胞中,观察减数分裂恢复情况。结果:在小鼠卵母细胞减数分裂过程中,Cdc25B能促进减数分裂的重新启动,其突变体(S321A)能完全解除PKA引起的G2期阻滞,完成减数分裂。结论:PKA通过Cdc25B的321位丝氨酸磷酸化修饰引起G2期阻滞,PKA/Cdc25B通路在小鼠卵母细胞减数分裂中发挥重要作用。

CyclinD1、CDC25B和p27在胃癌组织中的表达

目的探讨Cyclin D1、CDC25B和p27与胃腺癌发生发展及预后的关系。方法应用免疫组织化学法及Western blot方法检测42例胃腺癌组织,42例癌旁组织及42例正常胃黏膜组织中Cyclin D1、CDC25B和p27的表达,分析各蛋白与临床病理学指标之间的关系及各指标之间的相互关系。结果 Cyclin D1在正常黏膜、癌旁及胃腺癌组织中表达差异无统计学意义(P>0.05),CDC25B在胃腺癌组织表达与正常黏膜、癌旁组织表达比较明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),p27在胃腺癌组织中表达与正常黏膜、癌旁组织表达比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Cyclin D1及CDC25B在胃癌组织的表达与淋巴结转移相关,p27在胃癌组织的表达与组织学分级、浸润深度及淋巴结转移均相关,Cyclin D1、CDC25B在胃癌组织中表达呈正相关(r=0.392,P<0.05),Cyclin D1与p27表达无显著相关性(r=-0.062,P>0.05)。结论联合检测Cyclin D1、CDC25B和p27基因蛋白表达有望作为评估胃癌生物学行为和预后的新的参考指标。

14-3-3ε和Cdc25B在小鼠卵母细胞生发泡期阻滞中的作用

目的:研究14-3-3ε和Cdc25B对小鼠卵母细胞生发泡(GV)期阻滞作用的影响,为阐明蛋白激酶A/Cdc25B/14-3-3ε通路在小鼠卵母细胞GV期阻滞中发育调控机制奠定基础。方法:在体外将表达载体pcDNA3.1-ZEO-HA14-3-3ε、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321A和pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321D转录成mRNA。超排卵方法获得小鼠GV期卵母细胞,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组,收集各组母卵细胞后采用Western blotting法检测外源性14-3-3ε和Cdc25B蛋白表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态;相差显微镜观察卵母细胞的形态学变化并计数生发泡破裂(GVBD)率。结果:未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组在显微注射后20h均未发生GVBD(P>0.05);14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组在显微注射后1、2和3h卵母细胞的GVBD率分别为(5.00±0.68)%、(62.00±3.56)%和(100.00±0.00)%,显微注射后20h到达第2次减数分裂中期(MII)的比例为(79.00±2.80)%,与未注射组和TE缓冲液注射组比较,GVBD率和到达MII的比例均显著升高(P<0.01)。结论:14-3-3ε通过Cdc25B的321位丝氨酸磷酸化和脱磷酸化调控卵母细胞由GV期向GVBD的过渡。

CDC25B与恶性肿瘤研究进展

CDC25(A、B和C)是双特异性蛋白磷酸酶,在细胞周期中充当重要的角色。CDC25B是CDC25激酶家族的最重要成员,贯穿细胞周期的各阶段,在不同时期存在于细胞内不同的位置,其在细胞周期各期转换中起关键作用,在细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。肩负激活CDK1(cyclin dependent kinases-1)-cyclinB的重大责任,是早期有丝分裂的启动因子,同时也是卵母细胞恢复减数分裂的核心调控因子。CDC25B是磷酸化蛋白,其活性的调节是通过磷酸化和去磷酸化进行的,其编码基因定位于20p13,编码酪氨酸磷酸酶,已被认为是一种新的癌基因。过量CDC25B可促进肿瘤生长和细胞恶性转化。其基因过度表达可能发生在恶性肿瘤的早期阶段,进而引起CDC25B基因表达异常紊乱,发生肿瘤改变。CDC25B在多种肿瘤中如结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和非霍奇金氏淋巴瘤等均有过度表达,并且与患者预后相关,为恶性肿瘤预后不良的危险因素。CDC25B基因已成为恶性肿瘤治疗的新靶点,近年来已有研究并合成了CDC25B抑制剂,有望成为防治恶性肿瘤的可行途径之一。

CDC25B在肾癌细胞中的作用

目的:探讨CDC25B在肾癌组织和细胞中的表达状况及对肾癌细胞凋亡、运动以及侵袭力的影响。方法:免疫组化检测肾癌组织中CDC25B的表达,Western blot和RT-PCR检测CDC25B蛋白在肾癌769-P和ACHN细胞中的表达。挑选表达量大的细胞系转染CDC25B shRNA。MTT法检测细胞增殖能力。Annexin V-FITC/PI-FCM实验检测肾癌细胞凋亡。Transwell检测肾癌细胞侵袭力。结果:CDC25B在肾癌组织中高表达。CDC25B在肾癌769-P和ACHN细胞中均表达,ACHN的恶性度高于769-P,CDC25B在ACHN中表达高于769-P。CDC25B蛋白被干扰后,随着时间的延长,肾癌ACHN细胞的增殖能力显著降低,各时间组与浓度组之间差异具有统计学意义。CDC25B蛋白被干扰后,肾癌ACHN细胞的凋亡增加。体外运动减弱。小室侵袭实验表明,干扰组的细胞数低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。干扰后降低了肿瘤细胞的侵袭能力。结论:CDC25B在肾癌中的表现为原癌基因的作用,CDC25B与肾癌的恶性程度呈正相关。CDC25B可能成为肾癌潜在的诊断标记和新的判定肿瘤恶性度的指标。

149位丝氨酸在CDC25B诱导小鼠卵母细胞减数分裂中的功能

目的:研究小鼠卵母细胞减数分裂过程中,149位丝氨酸对CDC25B磷酸酶功能的影响。方法:将野生型CDC25B-WT和突变型CDC25B-S149A体外转录成mRNA,显微注射到小鼠GV期卵母细胞中,观察减数分裂恢复情况,同时检测了各组卵母细胞CDC2-Tyr15的磷酸化状态。结果:在小鼠卵母细胞减数分裂过程中,野生型CDC25B能促进减数分裂的重启动,活化有丝分裂促进因子,其突变体CDC25B-S149A对减数分裂的诱导作用丧失,不能活化有丝分裂促进因子。结论:149位丝氨酸的完整是CDC25B磷酸酶发挥调节功能所必需的。

小鼠Cdc25B融合蛋白构建和表达

目的研究小鼠N末端缺失286氨基酸的野生型Cdc25B原核表达载体的构建和表达。方法应用Primer5.0软件分析并设计小鼠Cdc25B5′及3′端引物(N末端缺失286氨基酶),化学合成并用聚合酶链反就(PCR)方法扩增,经限制性内切酶酶切后连接原核表达载体PGEX4T-2,构建成PGEX4T-2-Cdc25B融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21后,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导进行目的蛋白表达。结果通过双酶切、电泳分析及测序证明成功构建了Cdc25B融合表达载体,融合蛋白产物经蛋白印迹(Westernblot)显示,相对分子量为53KD的蛋白谱带,与预期一致。结论成功构建并表达了Cdc25B-N末端缺失的基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为近一步研究Cdc25B的功能提供基础依据。

胃癌组织中CyclinD1、CDC25B的表达变化及意义

目的观察胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B mRNA及蛋白的表达变化,并探讨其意义。方法收集手术切除胃癌组织标本42例份,同时取距肿瘤边缘>5 cm处作为正常黏膜组织。采用RT-PCR法检测胃癌及正常胃黏膜组织中Cyclin D1、CDC25B mRNA表达,采用Western blotting法检测胃癌及正常胃黏膜组织中Cyclin D1、CDC25B蛋白表达,分析Cyclin D1、CDC25B表达与胃癌患者临床病理特征的关系。结果 Cyclin D1、CDC25B mRNA及蛋白在正常胃黏膜组织中的相对表达量均显著低于胃癌组织(P均<0.05),Cyclin D1、CDC25B蛋白表达与胃癌淋巴结转移有关(P均<0.05),胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B蛋白表达呈正相关(r=0.513,P<0.05)。结论胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B呈高表达,且与胃癌淋巴结转移有关;检测二者水平有助于胃癌预后判断。

CDC25B在大肠肿瘤中的表达及意义

目的:探讨CDC25B(cell division cycle 25B,细胞分裂周期蛋白25B)在大肠肿瘤中的表达及临床意义. 方法:应用半定量的RT-PCR及免疫组化染色(S-P法)方法检测该基因在大肠癌(RT-PCR法,n=24;S-P法,n=168), 大肠腺瘤(RT-PCR法,n=62;S-P法,n=25)及大肠正常黏膜(RT-PCR法,n=10;S-P法,n=20)中的表达. 结果:CDC25B mRNA在大肠癌及大肠腺瘤中的相对含量明显高于正常大肠黏膜(1.41±0.07,1.32±0.17 vs 0.62±0.02,P<0.01),在大肠腺瘤伴轻-中-重度不典型增生组织中的相对含量逐渐增高(1.25±0.21,1.36±0.19和1.40±0.07,P<0.01);CDC25B基因翻译蛋白在正常大肠黏膜、腺瘤中未见表达,在大肠癌中以细胞核表达为主, 其表达与大肠癌有无远处脏器转移相关(2/46 vs 14/106, P<0.05);经随访发现CDC25B蛋白阳性表达者,5 a生存率明显降低(25/31 VS 42/82,P<0.05). 结论:CDC25B可能参与了大肠腺瘤到大肠癌的转变过程, 其在大肠癌发展中可能起一定作用,为大肠癌预后不良的危险因素.

N'-取代苯基-4-甲氧基苯磺酰脲类化合物的合成及其对Cdc25B抑制活性研究

以苯甲醚为原料,经氯磺化、氨化反应制得4-甲氧基苯磺酰胺3;取代苯胺与三光气反应制得取代苯基异氰酸酯5a^5q;5分别与3经缩合反应合成了17个新型的N'-取代苯基-4-甲氧基苯磺酰脲类化合物6a^6q,其结构经MS、IR和1H NMR表征确证。通过抗肿瘤活性初步测试,其中有5个化合物对Cdc25B具有一定的抑制作用。

14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响

目的:探讨14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响,为阐明14-3-3ε蛋白对小鼠卵母细胞发育的调控机制奠定基础。方法:采用超排卵方法获得3周龄昆明系雌性小白鼠生发泡(GV)期卵母细胞分为未注射组、control siRNA注射组和14-3-3εsiRNA注射组。构建pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε表达载体。间接免疫荧光技术检测14-3-3ε蛋白和Cdc25B在小鼠卵母细胞中的定位;直接免疫荧光技术观测14-3-3ε蛋白和Cdc25B蛋白在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsiRNA注射入GV期卵母细胞中,相差显微镜下观测卵母细胞的形态表现,计算卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)发生率;Western blotting法检测卵母细胞中14-3-3ε蛋白的表达和Cdc2-pTyr15蛋白的相对表达水平;放射自显影检测卵母细胞中成熟促进因子(MPF)的活性。结果:间接和直接免疫荧光实验,野生型Cdc25B能与14-3-3ε蛋白共定位于细胞质;在GVBD前期,Cdc25B由胞浆穿梭进入细胞核。当Cdc25B蛋白的第321位丝氨酸突变为丙氨酸时,14-3-3ε蛋白的表达水平降低,Cdc25B的胞浆定位被取消。未注射组、control siRNA注射组卵母细胞在显微注射24h后均未发生GVBD,GVBD发生率组间比较差异无统计学意义(P>0.05);14-3-3εsiRNA注射组在显微注射后22和24h卵母细胞的GVBD发生率均高于未注射组和control siRNA注射组(P<0.01),显微注射后24h卵母细胞到达第2次减数分裂中期(MII)的比例高于未注射组和control siRNA注射组(P<0.01)。结论:在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中,Cdc25B的Ser321位点可能是14-3-3ε蛋白调控Cdc25B细胞内定位的具体作用位点。

Cdc25B在小鼠受精卵的表达和定位

为阐明细胞分裂周期(Cdc)25B调控小鼠受精卵发育的机制,利用Western印迹检测小鼠受精卵各时期Cdc25B的表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。利用间接免疫荧光技术观察Cdc25B在小鼠受精卵的定位。构建pEGFP-Cdc25B融合表达载体并显微注射到受精卵中,观察Cdc25B在受精卵M期的定位变化。结果表明Cdc25B在G1和S期被磷酸化,在G2和M期去磷酸化。Cdc2-Tyr15在G1和S期处于磷酸化状态,G2期只检测到Cdc2-Tyr15轻微的磷酸化信号,M期未检测到任何Cdc2-Tyr15的磷酸化信号。Cdc25B在G1期定位于细胞质和细胞核中,S和G2期定位于细胞质的皮质部分,M期由细胞质转向核区。证明Cdc25B核输出后激活有丝分裂促进因子,从而启动小鼠受精卵的有丝分裂。

胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B和p27的表达及其临床意义

目的探讨Cyclin D1、CDC25B和p27表达与胃腺癌发生、发展及预后的关系。方法应用免疫组化及Western blot法检测42例胃腺癌组织及相应正常胃黏膜组织中Cyclin D1、CDC25B和p27的表达,分析三者表达与临床病理学特征的关系及相关性。结果 Cyclin D1在正常胃黏膜及胃腺癌组织中表达差异无统计学意义(P>0.05);CDC25B在胃腺癌组织中的表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);p27在胃腺癌组织中的表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),Cyclin D1及CDC25B在胃癌组织的表达与淋巴结转移相关,p27在胃癌组织的表达与组织学分级、浸润深度及淋巴结转移相关,Cyclin D1、CDC25B在胃癌组织中表达呈正相关(r=0.392,P<0.05),Cyclin D1与p27表达差异无显著相关性(r=-0.062,P>0.05)。结论联合检测Cyclin D1、CDC25B和p27表达有望作为评估胃癌生物学行为和预后的新参考指标。

Cdc25B蛋白过表达可使小鼠胚胎突破2-细胞期阻滞

目的:探讨Cdc25B蛋白过表达对小鼠2-细胞期胚胎发育的影响。方法:利用体外转录试剂盒将Cdc25B转录成mRNA,将mRNA显微注射入小鼠2-细胞期胚胎中,观察胚胎发育情况和卵裂率。用蛋白激酶活性测定方法和Western印迹分别检测Cdc25B蛋白过表达小鼠胚胎MPF的活性及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。结果:hCG后48 h,mRNA注射组有超过40%的2-细胞期胚胎分裂到4-细胞期而对照组仍停留在2-细胞期;激酶活性测定显示注射Cdc25B mRNA后,MPF的活性显著升高;Cdc2-Tyr15的磷酸化状态变化与激酶活性测定结果一致。结论:Cdc25B蛋白过表达可以激活有丝分裂促进因子(MPF),从而使小鼠2-细胞期胚胎突破2-细胞期阻滞,发育到4-细胞期。

小鼠Cdc25B核输出序列

为探讨小鼠卵母细胞中Cdc25B(cell division cycle 25 homolog B)核输出序列在卵母细胞G2/M转换过程中的调控机制,应用显微注射方法将Cdc25B的野生型、N末端缺失1～51位氨基酸片段(Cdc25B-Δ51)、1～65位氨基酸片段(Cdc25B-Δ65)突变体的mRNA和pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-Δ51、pEGFP-Cdc25B-Δ65的融合质粒显微注射到含有完整生发泡的小鼠卵母细胞中,观察不同注射组小鼠卵母细胞发生生发泡破裂的情况及蛋白质亚细胞定位。结果显示Cdc25B-Δ51及Cdc25B-Δ65都丧失了诱导小鼠卵母细胞减数分裂的能力;同时亚细胞定位研究表明在G2期野生型Cdc25B主要分布在细胞浆中,Cdc25B-Δ51在核浆均有分布,Cdc25B-Δ65则主要分布于细胞核中。研究结果表明Cdc25B在52～65位氨基酸之间存在核输出序列(nuclear export sequence,NES),NES参与的核转运机制作为一种重要的调控机制控制着细胞的生理进程;N末端的氨基酸对减数分裂的重启动起促进作用。

膀胱不同细胞系中CDC25B蛋白表达及意义

目的探讨膀胱癌不同细胞系中CDC25B蛋白表达及意义。方法采用蛋白印迹法检测CDC25B蛋白在膀胱永生化细胞SV-HUC-1细胞系和膀胱癌BIU-87和T24细胞系中的表达。结果 T24细胞中CDC25B蛋白表达水平高于BIU-87细胞和SV-HUC-1细胞系中的表达水平(P<0.05);且BIU-87细胞中CDC25B蛋白表达水平高于SV-HUC-1细胞中的表达水平(P<0.05)。结论 CDC25B可能成为评价肿瘤恶性程度的新指标。

吡唑[5,1-c]并三嗪类CDC25B抑制剂的合成

CDC25B(cell division cyclin 25B)的过度表达与许多肿瘤的发生有关,被认为是新的很有潜力的抗肿瘤药物的靶点。为了寻找抑制CDC25B的抗肿瘤新药,以氰乙酸乙酯、苯肼及不同取代的芳香重氮盐为原料,经关环、重氮化、偶合和分子内环合等反应设计并合成了8个含有吡唑[5,1-c]并三嗪母核的嘌呤生物碱类似物。所得化合物均未见文献报道,通过元素分析、红外光谱、核磁氢谱及质谱确定了其结构,其中化合物4e、4f、4g、4h对CDC25B的抑制率(%抑制率)分别为93.5,92.6,94.5和92.1,具有较好的生物活性。

细胞分裂周期因子CDC25B在肿瘤中作用的研究进展

细胞分裂周期因子25B(cell division cyclin 25B,CDC25B)作为细胞周期调控蛋白家族成员之一,定位于细胞质,参与细胞周期的转换及有丝分裂过程。CDC25B在多种肿瘤中高表达,是一种新发现的癌基因,CDC25B能阻滞细胞周期,进而调控肿瘤的进展,与肿瘤的发生发展密切相关。本文就CDC25B与肿瘤关系的研究进展作一综述。

白藜芦醇对甲状腺鳞癌细胞株SW579生长及CDC25B蛋白表达的影响

目的通过观察白藜芦醇对甲状腺鳞癌细胞株SW579生长及CDC25B蛋白(cell division cycle 25B)表达的影响,探讨白藜芦醇的抗癌作用机制。方法取对数生长期SW579细胞培养12h后,按浓度梯度25、50、100、200、400μmol.L-1加入白藜芦醇(实验组),对照组加入等体积含对应浓度DMSO的培养基,应用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期的变化,同时应用Western Blot方法检测CDC25B蛋白表达情况。结果不同浓度(25、50、100、200、400μmol.L-1)白藜芦醇对SW579细胞生长均有抑制作用,且呈剂量依赖性(P<0.05),并且改变细胞周期分布,实验组(100μmol.L-1白藜芦醇)S期[(28.55±0.58)%]比例明显高于对照组[(19.49±1.27)%](P<0.05),G2/M期[(8.79±0.74)%]比例显著低于对照组[(15.88±0.81)%](P<0.01),细胞分裂被阻滞。白藜芦醇作用24h后,与对照组(0.421±0.004)相比,实验组(100μmol.L-1白藜芦醇)(0.062±0.012)CDC25B蛋白表达明显下降(P<0.01)。结论白藜芦醇能够显著抑制SW579细胞株的增殖,使其处于S期阻滞,其抑制作用可能与CDC25B蛋白表达下降有关。

白血病抑制因子受体gp190细胞内区与HL-60细胞内Cdc25B激活的关系

目的 :观察白血病抑制因子 (L IF)受体 gp190亚基完整的细胞内区和 gp190胞内区 C末端片段在人白血病细胞系HL - 6 0中与细胞周期调控因子 Cdc2 5 B表达和激活的关系 ,进一步了解 L IF引发白血病细胞增殖抑制和分化的机制。 方法 :用基因重组技术将 gp130的细胞内区换成 gp190的细胞内区 ,用 PCR技术扩增合成 gp190细胞内区 C末端的一个多肽 ,构成嵌合体受体基因 130 /190及 190 CT片段 ,并分别在 HL - 6 0细胞表达。用免疫组化和 Western印迹方法 ,分析在 L IF的诱导下 ,细胞生长和形态与 Cdc2 5 B表达的关系。 结果 :转染 pc DNA 3.0 130 /190的 HL - 6 0细胞 Cdc2 5 B的表达量降低 ,细胞数量减少 ,细胞体积增大 ;转染 pc DNA3.0 190末端的 HL - 6 0细胞 Cdc2 5 B的表达量增高 ,细胞表现为增殖 ,细胞体积普遍减小。 结论 :Cdc2 5 B表达量降低与 L IF诱导引发的白血病细胞 HL - 6 0增殖抑制有关 ,上述效应是由 gp190亚基细胞内区介导的 ,而gp190 C末端片段可干扰 L