CDC28蛋白激酶调节亚基2对卵巢癌A2780细胞丝足形成的影响及其机制研究

目的探讨CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)对A2780细胞丝足形成的影响及其可能机制。方法采用慢病毒介导的sh RNA敲除A2780细胞的CKS2基因,显微镜下观察细胞丝足的变化;采用细胞划痕实验检测A2780细胞迁移能力的变化;采用real time PCR检测CKS2敲除对CDC42两种剪接变异体(CDC42-V1和CDC42-V2)表达的影响,以及不同卵巢癌标本中CKS2、CDC42-V1和CDC42-V2剪接变异体的表达情况。结果 CKS2表达抑制后,A2780细胞丝足明显减少,细胞迁移能力明显减弱(P<0.05),CDC42-V1 m RNA表达降低,而CDC42-V2 m RNA表达升高(P<0.05)。Real time PCR结果显示,卵巢癌组织标本中CKS2及CDC42-V1的表达高于对应的正常卵巢组织,而CDC42-V2的表达低于对应的正常卵巢组织(P<0.05)。结论 CKS2通过调控CDC42的选择性剪接而影响细胞丝足的形成,进而影响卵巢癌细胞A2780的迁移能力。

微RNA-126介导磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基2及磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B信号与肿瘤关系的新进展

磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基2(PIK3R2)是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的家庭成员之一,通过PI3K/蛋白激酶B(Akt)信号通路参与血管的形成、维护以及改造的调控,是组织器官正常发育、损伤以及肿瘤发生的一个重要的基因调控靶目标。不同类型的肿瘤,微RNA(miRNA)126介导的PIK3R2调控水平及趋势存在差异,可能与肿瘤的发生存在联系,是肿瘤研究中有前景的调控靶目标之一。

以蛋白激酶CK2为药物靶点的研究进展

蛋白激酶CK2是2000余种蛋白激酶中的一员，它是一种由两个催化亚基（α和／或α’）和两个调节亚基β构成的异源四聚体。目前已知CK2的底物达307种。该酶既能利用ATP又能利用GTP作为磷酸受体，具有高度组成型活性。CK2可在DNA复制和转录、RNA加工与翻译、蛋白质合成以及细胞代谢与运动、信号传导、细胞周期、细胞增殖与分化调节等方面发挥重要作用。CK2的α和α基因是原癌基因。CK2活性在许多实体瘤和白血病细胞中均增高。在药物诱导肿瘤细胞凋亡过程中，CK2被认为是细胞凋亡的抑制剂。

大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的生物信息分析

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)是调控细胞周期蛋白、维持细胞周期有序进行的关键蛋白。利用生物信息学方法在大豆疫霉基因组内共发现11个CDK家族蛋白,其中大豆疫霉ps Cdc2与勃利霉素抑制作用靶标的酵母Cdc28高度同源,位于进化树的同一分支,且两者蛋白的保守结构域高度相似。大豆疫霉的ps Cdc2为表达基因,其蛋白分子量为35 478 u,等电点为8.56的稳定存在的蛋白,无信号肽,为α/β型蛋白。与酵母Cdc28基因存在相互作用的10个蛋白在大豆疫霉基因组内全部找到其同源蛋白,说明大豆疫霉内可能存在类似的蛋白相互作用网络。

黄芩总黄酮对大鼠膝骨性关节炎软骨组织Camk2d、Ppp3r2表达的影响

目的:探讨黄芩总黄酮对大鼠膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)软骨组织钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ(Camk2d)、蛋白磷酸酶3调节亚基2(Ppp3r2)表达的影响。方法:采用膝关节腔内注射木瓜蛋白酶的方法制备大鼠KOA模型,阴性对照组和模型组大鼠灌胃给予生理盐水,黄芩总黄酮低、中和高剂量组大鼠灌胃给予黄芩总黄酮,剂量分别为12.5、25、50 mg/kg,阳性对照组大鼠灌胃给予塞来昔布(10 mg/kg),连续14 d后对大鼠膝关节进行病理学观察和Makin′s评分,同时ELISA法检测膝关节软骨组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6含量,蛋白质印迹法检测膝关节软骨组织中Camk2d和Ppp3r2表达水平。结果:模型组大鼠膝关节软骨纤维结缔组织增生,结构不清,伴炎症细胞浸润;黄芩总黄酮低剂量组大鼠膝关节软骨纤维结缔组织增生,细胞排列无规则,炎症细胞浸润,但较模型组明显改善,随着黄芩总黄酮剂量的增加,病变改善越明显。与阴性对照组比较,模型组大鼠膝关节软骨组织Makin′s评分,TNF-α、IL-1β、IL-6和Camk2d水平明显升高,Ppp3r2水平明显降低(P均<0.05);与模型组相比,黄芩总黄酮各剂量组及阳性对照组大鼠膝关节软骨组织Makin′s评分,TNF-α、IL-1β、IL-6和Camk2d水平明显降低,Ppp3r2水平明显升高,且黄芩总黄酮各剂量组效应呈剂量依赖性(P均<0.05);黄芩总黄酮高剂量组和阳性对照组间各指标差异无统计学意义(P均>0.05)。结论:黄芩总黄酮可能通过增加软骨组织中Ppp3r2表达,降低Camk2d表达,对大鼠KOA发挥治疗作用。

人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测

目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。

RGS4和D2受体信号通路相关分子在甲基苯丙胺依赖CPP大鼠纹状体的表达变化

目的:研究甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)依赖条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)实验大鼠纹状体G蛋白信号调节因子4(regulator of G-protein signal 4,RGS4)和多巴胺D2受体(dopamine receptor D2)信号通路相关分子的表达变化。方法:建立METH依赖CPP大鼠1周组、2周组,应用蛋白质印迹(Western blot)测定各组大鼠纹状体RGS4和D2、抑制性G蛋白α亚基(inhibitory G proteinα-subunit,Gαi)、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)蛋白表达的变化;应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组大鼠纹状体环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量的变化。结果:与生理盐水对照组相比,METH依赖1周组、2周组大鼠在伴药箱的平均停留时间明显延长(P<0.05)。与生理盐水对照组相比,RGS4蛋白在METH依赖1周、2周组的表达均明显下降(P<0.01),且与METH依赖1周组相比,2周组的下降更为明显(P<0.05);与生理盐水对照组相比,D2、Gαi、MAPK蛋白以及cAMP在METH依赖1周、2周组的表达均明显升高(P<0.01),且与METH依赖1周组相比,2周组的升高更为明显(P<0.05)。结论:在METH依赖的CPP大鼠纹状体中,RGS4和D2受体信号传导通路相关分子发生了改变,RGS4可能参与了METH依赖的CPP大鼠纹状体D2受体信号传导通路的调节。

β2受体兴奋剂治疗支气管哮喘利弊探讨

长期以来，β２受体兴奋剂和糖皮质激素一直被认为是治疗支气管哮喘最有效的方法，并通常联合使用。但全世界大多数地区哮喘的发病率和死亡率仍在增加［１、２］。本文拟通过对哮喘病理发展过程、糖皮质激素及β２受体兴奋剂药理作用的分析，探讨β２受体兴奋剂治疗哮喘的...

CKS1B在肺腺癌中的表达、临床和生物学意义分析

目的 探讨CDC28蛋白激酶调节亚基1B(CKS1B)在肺腺癌中的表达特点,以及临床和生物学意义。方法 采用Wilcoxon检验分析CKS1B在8个肺腺癌数据集中的表达特点;采用Kaplan-Meier曲线、Log-rank检验、多因素Cox回归分析CKS1B和肺腺癌预后的关系;采用Wilcoxon检验分析CKS1B和肺腺癌临床分期、TNM分期的关系;采用基因集富集分析CKS1B在肺腺癌组织中的生物富集特点;采用肿瘤单细胞、癌症细胞系百科全书数据库分析肺腺癌细胞中CKS1B的生物学意义;采用Maftools包分析CKS1B和肺腺癌驱动基因突变特点的关系。结果 CKS1B在肺腺癌组织中呈高表达,CKS1B高表达预示着较差的肺腺癌总生存期和无进展生存期,且是生存预后的独立危险因素(P<0.05);CKS1B和较高的临床分期、TNM分期有关(P<0.05);肺腺癌组织中、肺腺癌细胞中CKS1B皆显示与细胞恶性增殖呈正相关(P<0.05);CKS1B高表达的肺腺癌驱动基因突变更为紊乱剧烈。结论 CKS1B在肺腺癌中高表达,且预示着较差的临床分期和恶性生物学行为,有望成为肺腺癌防治的新靶点。

CKS1B参与拟穴青蟹性腺发育的研究

CDC28蛋白激酶调节亚基1B(CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B,CKS1B)是高度保守的CKS1家族成员之一,在细胞周期中作为细胞周期蛋白激酶的调节亚基参与调控真核生物的细胞分裂。因此,研究CKS1家族基因参与甲壳动物性腺发育调节的分子机制具有重要的意义。从已构建的拟穴青蟹性腺EST数据库中筛选到CKS1B基因片段,继而克隆出其全长c DNA序列(Sp-CKS1B),并利用q RT-PCR技术检测其在不同组织和性腺不同发育阶段中的差异表达。结果显示,获得Sp-CKS1B的全长c DNA序列722 bp,其中5'UTR为82 bp,3'UTR为379 bp,开放阅读框261 bp,编码86个氨基酸,包含一段典型的CKS保守序列,属于CKS家族蛋白。在不同组织q RT-PCR结果显示,Sp-CKS1B基因在O5期雌蟹卵巢中的表达水平最高,并与其他组织具有极显著差异(P<0.01);同时,在性腺不同发育阶段的表达结果显示,Sp-CKS1B基因在精巢T1期的表达量最高,其次为O5期,二者显著高于卵巢O1-O4期的表达水平(P<0.05);而在精巢T3期的表达量最低,并显著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表达水平(P<0.05)。结果说明了Sp-CKS1B在拟穴青蟹的性腺发育过程中可能具有十分重要的作用。

miR-485-5p靶向CKS1B对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响

目的探讨微小RNA(miR)-485-5p对鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移和上皮间质转化的影响及其机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-485-5p在人永生化鼻咽上皮细胞系NP69和人鼻咽癌细胞系CNE2中的表达情况;将体外培养的CNE2细胞分为Con组(正常培养)、NC组(转染mimics阴性对照)和mimics组(转染miR-485-5p mimics),实时荧光定量PCR测定miR-485-5p表达,噻唑蓝法、Transwell小室、流式细胞术分别检测细胞增殖活性、侵袭和迁移、凋亡,免疫印迹法检测细胞中E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和CDC28蛋白激酶调节亚基(CKS)1B蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-485-5p和CKS1B靶向关系。结果与NP69细胞比较,miR-485-5p在CNE2细胞中的表达水平明显降低(P<0.05)。与Con组、NC组比较,mimics组细胞中miR-485-5p表达水平、细胞凋亡率和E-钙黏蛋白表达水平均明显升高,而增殖活力、侵袭与迁移能力和N-钙黏蛋白、波形蛋白、CKS1B蛋白表达均显著降低(P<0.05)。miR-485-5p可与CKS1B靶向结合。结论miR-485-5p可能通过靶向调控CKS1B表达抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖、迁移、侵袭与上皮间质转化,并促进CNE2细胞凋亡。

白藜芦醇通过PI3K p85/Akt信号轴抗HepG2肝癌细胞增殖

目的研究白藜芦醇对肝细胞癌细胞增殖的影响,并进一步研究其影响机制。方法以不同浓度(0、12.5、25.0和50.0μmol/L)的白藜芦醇分别处理对数生长期的HepG2细胞,采用CCK8法和实时细胞分析仪(RTCA)系统检测细胞的增殖情况。4组细胞处理48 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,采用Western blot法检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)p85、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、总蛋白激酶B(t-Akt)和细胞周期素A2(CyclinA2)蛋白的表达。结果白藜芦醇对HepG2细胞的生长具有明显的抑制作用,并且随着时间的延长和白藜芦醇浓度的增高,HepG2细胞的活力越来越低。白藜芦醇作用48 h后,各个浓度白藜芦醇对细胞的抑制效应逐渐增大,且50.0μmol/L浓度下细胞的抑制效应最大。进一步的RTCA系统研究也发现,白藜芦醇对HepG2细胞的NCI值降低作用具有时间浓度依赖关系。流式细胞仪检测结果显示,12.5、25.0和50.0μmol/L白藜芦醇可以诱导HepG2肝癌细胞发生细胞凋亡。Western-blot结果表明,与0μmol/L比较,12.5、25.0和50.0μmol/L白藜芦醇可以降低HepG2细胞内PI3K p85、p-AKT和CyclinA2蛋白的表达水平(P<0.05),但4组细胞内的t-Akt的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论白藜芦醇可能通过PI3K p85/Akt信号轴来达到抗肝癌细胞增殖的作用,这为HCC的药物治疗提供了新的思路。