HBV相关肝细胞癌组织中CDC37基因启动子微卫星多态性及其与基因表达的关系

目的：探讨乙型肝炎病毒（ HBV）相关肝细胞癌（ HCC）组织中CDC37基因启动子区微卫星的多态性及其与基因表达的关系。方法22例接受手术治疗的HBV相关HCC患者，分别提取其癌组织和癌旁组织中的基因组DNA，PCR扩增CDC37基因启动子区含微卫星区段序列，并克隆至PMD-18T载体，每份标本至少挑选3个克隆进行测序，然后对HCC组织和癌旁组织、CDC37过表达的HCC组织与相应的癌旁组织、CDC37过表达和无过表达的HCC组织的启动子GT微卫星多态性组成形式进行比较分析。结果本组患者HCC组织和癌旁组织中CDC37基因启动子区存在（GT）n1-GC-（GT）n2多种类型的微卫星形式，位于CDC37启动子区1368～1415位，以（GT）10-GC-（GT）9最为常见。 HCC组织与癌旁组织的CDC37启动子微卫星多态性形式的总体分布相比，P＞0．05；CDC37过表达HCC组织与相应的癌旁组织的微卫星的总体分布相比，P＞0．05；而CDC37过表达和无过表达HCC组织的微卫星的总体分布相比，P＜0．05，其中（GT）10-GC-（GT）9形式在CDC37过表达患者中所占比例高于无过表达患者，两者相比，P＜0．05，（GT）10-GC-（GT）12形式在CDC37无过表达患者中所占比例高于过表达患者，两者相比，P＜0．05。结论 HBV相关HCC患者癌组织中CDC37基因启动子区存在微卫星多态性，CDC37过表达和无过表达HCC组织的微卫星形式有不同。

不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率

【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P<0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。

HBV复制及不同基因表达不影响CDC37水平

目的研究HBV复制和不同基因表达是否会影响肝细胞内CDC37的表达水平。方法首先扩增HBV6种基因P、preS1、preS2、S、C和X,并构建至pCMV表达载体,分别转染Huh7和HepG2细胞系,Western blot检测CDC37表达水平;另外将含CDC37基因启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL3与HBV的6种基因表达质粒分别共转染Huh7和HepG2细胞系,检测荧光素酶信号。其次分别构建B、C、D和CD重组体4种HBV基因型毒株的1.28拷贝全基因质粒,运用AdEasy腺病毒系统进行重组和包装后分别感染Huh7和HepG2细胞系,并检测CDC37表达水平。结果基因表达结果显示,HBV6种基因的表达对肝癌细胞系内CDC37的表达水平无明显影响,而且HBV6种不同蛋白的表达对CDC37启动子的活性无明显影响。1.28拷贝HBV全基因质粒的感染结果显示,HBV不同基因型毒株的复制对CDC37基因的表达水平亦无明显影响。结论 HBV的复制和不同基因的表达不会明显影响CDC37的表达水平。

人Cdc25B基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

目的构建人细胞分裂周期25家族蛋白B(Cdc25B)基因启动子(promoter)荧光素酶报告基因载体p GL3-Cdc25B-promoter,并检测其转录活性。方法应用欧洲启动子在线数据库(EPD)获得人Cdc25B基因5'端非编码区处包含转录起始位点在内的-2000^+100的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,并插入到p GL3-Basic荧光素酶报告基因载体上。通过设计不同引物,进一步构建系列缺失体,共获得7个不同长度启动子序列的报告基因载体。将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染He La细胞,通过双荧光素酶报告基因活性测定实验检测不同缺失体的转录活性。利用定点突变及RNA干扰(RNAi)探究预测的转录因子对Cdc25B转录活性的影响。结果构建的人Cdc25B基因启动子荧光素酶报告基因载体p GL3-Cdc25B-promoter经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转染He La细胞后,检测到荧光素酶高表达(P<0.05)。启动子系列缺失分析显示-160^-53片段包含基本核心启动子,与生物信息学的预测结果一致。定点突变及RNA干扰显示NF-YB转录因子对Cdc25B起正调控作用。结论成功构建了7个具有转录活性的人Cdc25B启动子缺失片段,确定了NF-YB是Cdc25B转录的一个重要调控因子,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

新疆哈萨克族食管癌中Cdc42基因启动子区甲基化与其mRNA表达改变的研究

目的研究新疆哈萨克族食管癌中Cdc42基因启动子区甲基化状态与其mRNA表达改变的关系。方法用RT-PCR方法测定mRNA表达,甲基化特异PCR方法检测DNA启动子区甲基化状态。结果在20例癌组织中,有16例表达阳性,占80%,20例癌旁组织中有13例表达,占65%,其中癌组织表达量明显高于癌旁组织的有10例,占50%,癌旁组织表达量高于癌组织的有5例,占25%。肿瘤组织和正常组织该基因启动子区见甲基化条带,未见非甲基化条带。结论Cdc42基因在肿瘤组织和正常组织均表现为高甲基化状态,新疆哈萨克族食管癌中Cdc42基因mRNA表达增强可能与该基因的甲基化状态没有直接关系,另存在其他机制,有待进一步研究。

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。