VAV2蛋白DH结构域与CDC42蛋白相互作用的亲和力和热力学参数研究

目的:利用等温滴定量热技术研究VAV2蛋白的DH结构域(VAV2-DH)与CDC42的相互作用。方法 :首先分别将VAV2-DH和CDC42蛋白的编码基因克隆至pGEX-6p-1和pET28a载体上,构建VAV2-DH和CDC42蛋白的重组表达载体。再将重组表达载体转入大肠杆菌中诱导表达蛋白,并亲和层析、凝胶过滤层析纯化得到VAV2-DH和CDC42蛋白,最后利用鸟嘌呤核苷酸交换试验来验证VAV2-DH的鸟苷酸交换活性,并采用等温滴定量热技术检测这2种蛋白质相互作用的亲和力和热力学参数。结果:VAV2-DH和CDC42蛋白的平衡解离常数K_(D)=(11.44±2.12)μmol/L,其中摩尔结合焓DH=(-224.33±95.48) kJ/mol、-TDS=(195.97±95.95) kJ/mol、吉布斯自由能DG=(-28.30±0.49) kJ/mol。结论:VAV2-DH和CDC42蛋白属于中等强度的相互作用,是一个焓驱动的结合过程。

CDC28蛋白激酶调节亚基2对卵巢癌A2780细胞丝足形成的影响及其机制研究

目的探讨CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)对A2780细胞丝足形成的影响及其可能机制。方法采用慢病毒介导的sh RNA敲除A2780细胞的CKS2基因,显微镜下观察细胞丝足的变化;采用细胞划痕实验检测A2780细胞迁移能力的变化;采用real time PCR检测CKS2敲除对CDC42两种剪接变异体(CDC42-V1和CDC42-V2)表达的影响,以及不同卵巢癌标本中CKS2、CDC42-V1和CDC42-V2剪接变异体的表达情况。结果 CKS2表达抑制后,A2780细胞丝足明显减少,细胞迁移能力明显减弱(P<0.05),CDC42-V1 m RNA表达降低,而CDC42-V2 m RNA表达升高(P<0.05)。Real time PCR结果显示,卵巢癌组织标本中CKS2及CDC42-V1的表达高于对应的正常卵巢组织,而CDC42-V2的表达低于对应的正常卵巢组织(P<0.05)。结论 CKS2通过调控CDC42的选择性剪接而影响细胞丝足的形成,进而影响卵巢癌细胞A2780的迁移能力。

CDC42EP2基因与肝癌预后、免疫细胞浸润关系及其对细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨CDC42EP2基因与肝细胞癌(肝癌)患者预后和免疫细胞浸润的关系及其对细胞迁移侵袭的影响。方法 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载肝癌组织与正常肝组织中CDC42EP2基因表达谱数据,分析肝癌组织CDC42EP2基因表达与临床病理特征的相关性,并用Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存预后分析;利用HCCDB数据库分析CDC42EP2的共表达网络;利用TIMER2.0数据库探讨CDC42EP2表达与免疫细胞浸润的相关性;采用siRNA技术抑制HepG2肝癌细胞中CDC42EP2基因表达,qRT-PCR及Transwell实验分别检测CDC42EP2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 TCGA数据库分析显示,肝癌组织CDC42EP2表达明显高于正常肝组织(P<0.05),肝癌组织CDC42EP2表达与肝癌病理组织学分级、TNM分期、TP53突变相关(P<0.05)。肝癌组织CDC42EP2高表达患者中位生存时间为41.0个月,明显低于低表达患者的84.4个月(HR=1.86,P<0.05)。CDC42EP2表达与辅助性T细胞(Th)、中央记忆型T细胞(Tcm)及Th2细胞浸润成正比,而与树突状细胞(DC)及Th17细胞浸润成反比(r=0.179,0.172,0.144,-0.125,-0.182;P<0.05)。siRNA敲低CDC42EP2基因后,HepG2肝癌细胞迁移和侵袭能力显著降低。结论 肝癌组织CDC42EP2基因高表达,其高表达与肝癌预后不良有关。敲低CDC42EP2基因可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。

Cdc42基因在非甾体抗炎药抑制乳腺癌细胞丝状伪足形成中的作用

目的:研究细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)基因在非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)诱导抑制细胞丝状伪足形成中的作用,探究NSAIDs抑制在肿瘤细胞迁移和侵袭过程中可能的信号转导途径。方法:使用环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,Cox-2)选择性抑制剂NS-398处理乳腺癌MCF-7细胞,同时将针对Cox-2的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染入MCF-7细胞;利用实时荧光定量-PCR和Western印迹法检测NS-398处理组、Cox-2 siRNA干扰组、干扰阴性对照组和空白对照组细胞中Cox-2和Cdc42的mRNA转录水平以及蛋白表达水平;使用微丝绿色荧光探针观察MCF-7细胞的伪足形态;Transwell小室检测MCF-7细胞的体外侵袭能力。结果:乳腺癌MCF-7细胞经NS-398处理后,细胞丝状伪足消失,体外侵袭能力显著下降(P<0.05);Cox-2mRNA转录及蛋白表达水平均未见明显改变(P>0.05),Cdc42 mRNA及总蛋白表达水平也未见明显改变(P>0.05),但活化态Cdc42含量显著减少(P<0.05)。经siRNA干扰Cox-2表达后,MCF-7细胞的丝状伪足消失,体外侵袭能力显著下降(P<0.05),活化态Cdc42含量显著减少(P<0.05)。结论:NSAIDs在体外抑制肿瘤细胞侵袭的作用可能是通过抑制Cox-2活性,使活化态Cdc42含量减少,最终抑制细胞丝状伪足形成而实现的。

细胞内Ca^2+在轮状病毒感染对Caco-2细胞NHE3蛋白调控中的作用

目的研究轮状病毒(rotavirus,RV)感染对Caco-2细胞表面钠-氢(Na^+-H^+)交换蛋白3(NHE3)水平和生物活性的影响及其调控机制。方法构建表达NHE3的Caco-2细胞模型,分为对照组(CTL组)、RV组、细胞内Ca^2+络合剂BAPTA-AM组和BAPTA-AM+RV组,用BCECF-AM法和细胞表面NHE3生物素化法测定Na^+-H^+交换蛋白活性和细胞表面NHE3蛋白水平,Western blot测定细胞Cdc42蛋白水平。结果与CTL组相比,RV感染可引起细胞Na^+-H^+交换蛋白活性以及细胞表面NHE3蛋白水平明显降低,此抑制作用可被BAPTA-AM拮抗,此外RV感染可引起Cdc42蛋白水平升高,这一作用也可被BATPA-AM拮抗。结论RV感染对NHE3蛋白水平及生物活性的调控可能与细胞内Ca^2+介导的Cdc42依赖性内吞途径有关。

PAK1在结直肠癌增长和转移中的作用

PAKs（p-21活化激酶）是分子量21 kD,Rho家族的小GTP酶;在哺乳动物中PAK有6种,可分成第1组PAKs（PAK1～3）和第2组PAKs（PAK4～6）。PAK1（p-21活化激酶1）是第1个被鉴定并且研究最多的PAK家族成员,PAK1的效应蛋白为Rac和Cdc42,在细胞形成、运动、生存和增殖调节中起重要作用;同时,在肿瘤的发生、发展过程中,PKA1也发挥着重要的作用。研究证实,PAK1与结直肠癌的侵袭和转移密切相关。