CDC50A在宫颈癌原代细胞中的表达及对干细胞特性的影响

目的:探讨人宫颈癌原代细胞的分离、培养、鉴定方法以及细胞周期蛋白50A(CDC50A)对其生物学特性的维持作用。方法:收集2017年1月~2018年2月期间在妇科进行宫颈手术的24例宫颈癌患者和10例行子宫全切术患者的宫颈组织标本;采用蛋白酶消化法分离宫颈癌组织,通过原代培养、流式细胞术分选法将宫颈癌原代细胞分为CDC50A^(+)Lin^(-)细胞组,CDC50A-Lin^(-)细胞组,采用MTT法测定各表型细胞体外增殖活性以及体内成瘤能力;采用端粒重复扩增法(TRAP)结合电泳及银染法测定端粒酶活性。结果:①宫颈癌原代细胞表型CDC50A^(+)Lin^(-)的细胞仅占0.95%~5.64%;且宫颈癌组织中CDC50A阳性表达率为87.5%,明显高于正常宫颈黏膜组织,差异有统计学意义(P<0.05);②CDC50A^(+)Lin^(-)细胞体外增殖活性以及集落形成能力明显高于CDC50A-Lin^(-)细胞和未分选细胞,差异有统计学意义(P<0.05);③裸鼠皮下接种CDC50A^(+)Lin^(-)细胞,2周就可观察到明显的新生肿瘤块,成瘤率明显高于接种CDC50A-Lin^(-)细胞和未分选细胞,差异有统计学意义(P<0.05);④CDC50A^(+)Lin^(-)细胞端粒酶相对表达强度为显著高于对照组细胞和CDC50A-Lin^(-)细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CDC50A有可能是分选人宫颈癌干细胞的表面标志物,CDC50A^(+)Lin^(-)细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性。

稳定表达CDC50A的卵巢癌细胞株的建立及鉴定

目的以分子克隆技术建立稳定表达人细胞周期调控蛋白50A(CDC50A)的SKOV3细胞株。方法通过分子克隆技术将CDC50A定向连接到表达载体pLVX-IRES-GFP上。pLVX-CDC50A-GFP表达质粒经慢病毒包装,稳定转染SKOV3,建立稳定表达CDC50A的SKOV3细胞株,通过流式细胞测量术、免疫印迹、免疫荧光分析其Flag标签蛋白表达。结果通过电泳及酶切鉴定证实了pLVX-CDC50A-GFP表达载体的构建,荧光显微镜定性观察病毒感染效率,流式细胞测量术检测感染效率为86.5%,免疫印迹法只检测到pLVX-CDC50A-GFP表达质粒的SKOV3细胞株有Flag标签蛋白表达,阴性对照组无蛋白表达。结论成功构建了CDC50A的表达载体,并通过慢病毒感染建立了过表达CDC50A的SKOV3细胞株,为开展CDC50A在卵巢癌中的机制研究奠定了基础。

通过足细胞Cdc50a基因敲除构建一种全新的肾小球硬化症小鼠模型

细胞膜内外层磷脂分布的不对称性是由磷脂翻转酶维持的,当磷脂翻转酶功能缺失时,细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸会暴露至细胞表面,引发细胞凋亡。CDC50A是磷脂翻转酶的重要组成亚基。本研究敲除小鼠足细胞Cdc50a基因后,发现足细胞变形受损,产生慢性肾病的早期症状,即产生蛋白尿;随着月龄的增加,基因敲除鼠足细胞损伤及丢失加剧、肾小球的滤过屏障功能严重受损,出现肾小球滤过率降低、肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质堆积、局灶性节段性肾小球硬化等一系列病理表型改变。结果证实了细胞膜磷脂分布的不对称性对足细胞的存活和肾小球滤过屏障的完整性至关重要,并由此构建了一种全新的自发性肾小球硬化症小鼠模型。

酿酒酵母细胞cdc50基因敲除及其转录组测序分析

为探讨cdc50基因对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞功能的影响,该研究以PYM14质粒为模板,采用醋酸锂转化法对野生型酿酒酵母BY4742进行cdc50基因敲除,测定突变菌株Δcdc50生长情况,分别对野生型酵母菌株BY4742和突变菌株Δcdc50进行转录组分析,筛选二者差异表达基因(DEGs),并对其进行基因本体论(GO)、京都基因与基因百科全书(KEGG)富集分析。结果表明,成功构建酿酒酵母cdc50基因缺失菌株Δcdc50,cdc50基因缺失后酵母细胞形态由圆形变为杆状,培养12 h后菌株Δcdc50相对生长率为1.98%,较野生型酵母BY4742菌株显著降低(P<0.05)。与野生型酵母菌株BY4742相比,菌株Δcdc50的DEGs共有581个,其中271个基因上调,310个基因下调。GO富集分析表明,DEGs主要富集在生物学过程中的氧化还原过程等,分子功能中的氧化还原酶活性、辅助因子结合和跨膜转运体活性等。KEGG富集分析表明,DEGs主要富集于糖酵解/糖异生、脂肪酸降解和碳代谢通路等。

真菌中的脂质不对称调节和P4型ATP酶

脂质组分在双分子膜中不对称分布是广泛存在于真核细胞中的现象,有助于膜系统的出芽和融合,从而促进胞吞胞吐、蛋白分选运输等生理过程。多种蛋白参与维持脂质不对称,其中P4型ATP酶是重要的脂质转运体。P4型ATP酶又称脂质翻转酶,主要介导氨基磷脂的转位。在酿酒酵母、新生隐球菌、白念珠菌和构巢曲霉中,多种P4型ATP酶亚基的缺失导致蛋白运输失常,对唑类药物的敏感性升高,细胞壁完整性受损,毒力减低,在巨噬细胞中生存能力减弱等表型,提示脂质翻转酶的重要性及其作为抗真菌靶点的潜力。

人源CDC50基因的分子克隆及在E.coli中的表达

糖皮质激素受体 (GR)为一种特异性配体诱导的转录因子在机体发育、生理及行为等过程中发挥重要作用 .这一过程往往受到转录协同调节因子的控制 ,包括协同抑制因子或协同激活因子的作用 .克隆了人源双跨膜受体分子 ,并命名为hCDC5 0 .该分子编码区有 10 5 6bp ,与鼠源基因mCDC5 0在核苷酸水平有 90 %一致性 .将hCDC5 0蛋白的 16 4～ 317编码序列与GST融合构建原核表达质粒进行重组蛋白的表达与纯化并制备多抗 .用二维双向扩散检测抗体为阳性 ,抗原的滴度为12 5 μg/ml.体外翻译研究显示该基因编码蛋白约为 4 0kD ,与Western检测在动物细胞中的表达一致 .用hCDC5 0真核表达质粒与GR萤光报告系统共转染COS 7细胞显示 ,hCDC5 0对GR信号转导有明显的抑制作用 ,其对GR信号通路的抑制作用达 3～ 4倍以上 .hCDC5 0可能为一个新的协同抑制因子 。