CDK2-抑制剂结合自由能计算

细胞周期蛋白依赖性激酶II (cyclin dependentkinase 2 ,CDK2 )是一种重要的治疗癌症的靶标 .本文中采用分子动力学取样 ,运用MM PBSA/GBSA两种方法计算了CDK2 NU610 2复合物的绝对结合自由能 .通过能量分解的方法考察了CDK2大分子主要残基与配体NU610 2之间的相互作用和识别 .

CDK2、p21和p27在生长激素腺瘤中的表达及CDK2抑制剂的体外应用

目的分析细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期调节因子p21和p27在生长激素腺瘤中的表达水平,观察CDK2抑制剂环O6-己基甲基鸟嘌呤(O6)对GH3细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法构建包含3例垂体和46例腺瘤标本的组织芯片,按Knosp分级将肿瘤分为侵袭组(n=15)和非侵袭组(n=31),免疫组织化学技术分析CDK2、p21和p27的蛋白水平,结合随访信息分析其与临床特性的关系。GH3细胞分为O6组(0.4μmol/L和4μmol/L)和二甲基亚砜组(DMSO),细胞增殖实验MTS法检测细胞活力;Annexin V实验检测细胞凋亡;Brdu实验检测细胞周期,Western blotting实验检测CDK2、p21和p27变化。结果腺瘤标本中CDK2、p21和p27的H-score评分分别为(104.8±28.3)分、(195±39.2)分、(158.8±32.3)分,CDK2在侵袭组表达较非侵袭组明显增高[(140±31.7)分vs.(87.8±26.7)分],p21[(152.3.1±35.2)分vs.(215.7±41.2)分]和p27[(118.1±28.4)分vs.(173.7±34.3)分]则明显降低(P<0.05)。O6处理GH3细胞后,细胞活力与DMSO组相比,不同剂量O6处理组细胞活力分别为DMSO组的(84.5±7.6)%和(76.2±7.1)%(24 h)、(75.7±7.3)%和(69.6±6.2)%(48 h)、(70.2±6.4)%和(61.3±5.5)%(72 h)。处理24 h后,O6组Annexin V阳性细胞分别为(8.86±1.78)%(P<0.05)和(19.36±4.20)%(P<0.01),而DMSO组为(3.35±0.73)%,PI阳性则分别为(3.82±0.53)%(P<0.05)、(10.14±2.65)%(P<0.01)和(1.34±0.33)%。Brdu实验显示,O6将GH3细胞阻滞在G1期,分别为(50.4±4.1)%和(59.4±4.7)%(P<0.05),DMSO组为(45.7±3.7)%。同时,蛋白印迹实验显示,O6处理后p21和p27呈现升高趋势(P<0.05)。结论CDK2、p21和p27表达与生长激素腺瘤侵袭密切相关,其抑制剂O6-己基甲基鸟嘌呤诱导GH3细胞凋亡,抑制细胞增殖。

CDK2别构小分子抑制剂的虚拟筛选和体外活性研究

目的根据CDK2的晶体结构(PDB ID:3PXF),在已验证的别构口袋处,拟筛选出CDK2新型别构小分子抑制剂。方法通过计算机辅助药物设计方法,基于CDK2蛋白晶体别构位点进行虚拟筛选,综合分析化合物与CDK2的作用模式;构建CDK2体外激酶活性检测体系,对化合物进行初步的体外生物活性研究。结果虚拟筛选得到打分前1 000名的化合物,最终挑选并购买10个候选化合物。其中,化合物S2和S5表现出较好的抑制效果,在100μmol/L的浓度下对CDK2活性的抑制率分别为57.59%和41.64%。结论综合利用虚拟筛选、结构分析以及生物活性测试,筛选出具有明显的CDK2抑制活性的先导化合物S2和S5,为设计开发新型的CDK2别构小分子抑制剂奠定了基础。

新型CDK2-cyclinA2小分子抑制剂的设计、合成及生物学活性研究

目的·设计、合成新型CDK2-cyclin A2小分子抑制剂并探讨此类抑制剂的构效关系。方法·通过计算机辅助药物设计方法,以CDK2-cyclin A2晶体ATP结合区域为口袋,筛选出先导化合物。根据CDK2-cyclin A2的ATP结合区域特点,设计合成一系列苯磺酰胺类化合物;根据已构建好的体外激酶活性检测体系,对化合物体外活性进行研究。结果·合成了29个新型苯磺酰胺类CDK2-cyclin A2抑制剂,化合物对CDK2-cyclin A2抑制检测结果显示,WZ-026对CDK2-cyclin A2抑制作用的IC_(50)值为3.81μmol/L。结论·综合虚拟筛选、化学合成、生物检测等方法,得到对CDK2-cyclin A2有明显抑制活性的苯环酰胺类化合物WZ-026;初步得到此类小分子化合物与CDK2-cyclin A2的作用模式。

高通量虚拟筛选CDK2/Cyclin A2靶点抑制剂

CDK2/Cyclin A2复合蛋白的异常表达与乳腺癌、口腔癌、食管鳞状细胞癌的发生密切相关.CDK2/Cyclin A2复合蛋白的活性位点不同于CDK2单体.至今临床上尚无靶向此复合蛋白的药物分子.针对CDK2/Cyclin A2复合蛋白,以实验报道的10个抑制剂分子构建药效团模型,通过药物体外药代动力学(ADME)、Docking、聚类分析、毒性预测,从DrugBank,ChEMBL和TCM@Taiwan 3个数据库约90万组数据中进行高通量虚拟筛选,进一步进行MD模拟、MM/PBSA结合自由能计算、能量分解和平均非共价作用(aNCI)分析,筛选出3个抑制效果优于阳性实验药Roscovitine的先导分子:DrugBank-2004,DrugBank-583和ChEMBL-7122.与CDK2蛋白相比,CDK2/Cyclin A2复合蛋白结合位点空间变大,先导分子与Lys33,Asp86,Lys129和Asp145残基之间的排斥作用有所降低,导致结合自由能更大.

DNA损伤反应中细胞周期检查点蛋白p27^(Kip1)表达及其调控机制

为了研究DNA损伤反应中p2 7Kip1的表达及其调控机制 ,应用免疫印迹的实验结果表明 :10Gy 60 Coγ射线照射后 3h ,HeLa细胞中p2 7Kip1蛋白水平开始下降并持续到 2 4h ,进而失去它对CDKs的抑制功能 .Northern印迹结果显示 ,电离辐射 (IR)对p2 7Kip1mRNA表达水平无明显影响 ,说明电离辐射诱导p2 7Kip1表达水平的降低主要与蛋白质降解相关 ,但其具体的调控机制还不清楚 .已知在G1—S期p2 7Kip1蛋白的降低主要依赖细胞周期蛋白E Cdk2激酶将其磷酸化后的泛素化蛋白酶体途径 (ubiquitin proteasomepathway) .酶动力学研究结果揭示 :电离辐射后细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性增高 ,12h细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性达到最大 .当在照前用细胞周期蛋白E Cdk2抑制剂olomoucine (10 μmol L)抑制细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性时 ,p2 7Kip1蛋白表达水平增加 .此外 ,还观察到电离辐射可诱导p2 7Kip1泛素化水平的增高 ,而在使用蛋白酶体抑制剂MG 132 (5 μmol L)处理HeLa细胞后 ,可抑制辐射诱导p2 7Kip1蛋白水平的下调 .研究结果提示 :泛素化蛋白酶体途径参与了辐射诱导P2 7Kip1蛋白表达下调的降解机制 .

CDK抑制剂的研究进展

周期蛋白依赖性激酶是一类丝/苏氨酸激酶,是一种细胞内重要的信号转导分子。目前以细胞周期蛋白依赖性激酶为靶点的药物可以阻断细胞的周期,控制细胞的增殖,从而达到抗肿瘤的目的。文章简单的对几种与肿瘤相关的CDK抑制剂进行综述,对新的CDK抑制剂研发提供背景分析。

ROCK抑制剂Y-27632在体外培养的兔角膜内皮细胞紫外线损伤修复中的作用

目的探讨ROCK抑制剂Y-27632在兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells,RCECs)紫外线损伤修复中的作用。方法收集30只健康成年新西兰大白兔的角膜,显微镜下撕除角膜后弹力层和内皮层,用胰蛋白酶消化法获得原代RCECs。选取第2代处于对数生长期的RCECs分为三组A组为正常对照组,RCECs为常规培养液培养;B组为紫外线照射组,RCECs经紫外线照射20 s制备细胞损伤模型,常规内皮细胞培养液培养;C组为紫外线照射+Y-27632组,在细胞损伤模型中加入终浓度10μmol·L^(-1)的Y-27632细胞培养液培养。采用MTT比色法检测各组细胞活性。采用Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移能力。利用BrdU细胞增殖实验检测各组细胞的增殖能力。运用细胞黏附实验检测各组细胞黏附性。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞周期蛋白(CyclinD1)和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKN1B)mRNA的相对表达量。Western blot法检测各组CyclinD1和细胞周期蛋白依赖激酶(Cdk2)的表达情况。结果MTT比色法检测结果显示,B组细胞的活性(80.61±3.40)%低于A组(100%)和C组(92.55±4.56)%,差异均有统计学意义(P=0.000、0.025)。Transwell迁移实验结果显示,B组迁移细胞数目(39.3±4.4)个/高倍视野较A组(77.0±6.7)个/高倍视野和C组(54.3±3.4)个/高倍视野减少,差异均有统计学意义(P=0.023、0.015)。BrdU细胞增殖实验检测结果显示,B组细胞光密度值(0.24±0.05)较A组(0.35±0.08)和C组(0.30±0.07)降低,差异均有统计学意义(P=0.001、0.015)。细胞黏附实验结果显示,B组细胞黏附性(0.183±0.010)较A组(0.541±0.010)和C组(0.353±0.030)下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000)。实时荧光定量PCR检测结果显示,与A组相比,B组的CyclinD1 mRNA相对表达量(0.49±0.10)下降,CDKN1B mRNA相对表达量(1.25±0.20)上调,差异均有统计学意义(P=0.003、0.002);C组CyclinD1 mRNA的相对表达量(0.80±0.12)比B组(0.49±0.10)增加,C组CDKN1B mRNA的相对表达量(0.90±0.16)比B组(1.25±0.20)减少,差异均有统计学意义(P=0.013、0.022)。Western blot检测结果显示,B组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量分别为(0.21±0.09)和(0.38±0.10),均低于A组(0.43±0.12)、(0.62±0.19),差异均有统计学意义(P=0.014、0.005);C组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量分别为(0.34±0.11)和(0.51±0.14),均高于B组,差异均有统计学意义(P=0.027、0.002)。结论ROCK抑制剂Y-27632能增强紫外线损伤的RCECs活性,促进细胞迁移、黏附和增殖。

红树林内生真菌来源内酯类化合物D1952抗肿瘤活性研究

目的探讨红树林老鼠簕内生真菌来源内酯类化合物D1952抗肿瘤作用及分子机制。方法分子对接技术寻找D1952的潜在靶点,四甲基二氮唑蓝(MTT)比色法研究D1952抗肿瘤谱;脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)、PI染色法、免疫印迹法(Western blotting)检测D1952对细胞周期和凋亡的影响及相关信号通路蛋白的变化。结果细胞周期蛋白激酶2(CDK2)是D1952的潜在靶点;D1952能有效抑制21种肿瘤细胞的增殖,且对MDA-MB-435的半数抑制浓度(IC50)为1.11μmol/L。TUNEL染色可见肿瘤细胞凋亡明显;流式细胞术表明其能将MDA-MB-435细胞阻滞于G1/S期,且D1952能促进PARP的切割、导致p-RB降低和p21的表达增加。结论红树林老鼠簕内生真菌来源化合物D1952具有较好的抗肿瘤活性,并有望成为靶向CDK2的抗肿瘤先导化合物。

HnRNP A1-CDK2调控口腔鳞状细胞癌的发生发展

目的:分析核不均一性核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNP A1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependentkinase 2,CDK2)在口腔鳞状细胞癌中的表达。抑制hnRNP A1表达对CDK2以及口腔癌细胞增殖的影响。观察CDK2抑制剂(Dinaciclib)对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响。方法:免疫组化分析口腔癌组织以及癌旁组织中hnRNP A1、CDK2的表达。体外培养口腔鳞状细胞癌细胞系CAL27进行ShRNA转染构建稳定表达细胞系,qRT-PCR与Western Blot法检测细胞hnRNP A1、CDK2的mRNA表达以及蛋白表达水平。以CDK2抑制剂(Dinaciclib)梯度浓度处理CAL27细胞,CCK-8法检测细胞活性以选择最佳给药浓度。以最佳药物浓度Dinaciclib处理CAL27细胞,作用24 h和48 h进行细胞计数,qRT-PCR和Western Blot法检测CDK2的mRNA和蛋白质表达水平。结果:与癌旁组织相比,hnRNP A1、CDK2在口腔癌组织中的表达水平显著增高。稳定转染降低CAL27细胞中hnRNP A1表达后,与对照组相比,CDK2的表达随之降低,细胞增殖受到抑制。Dinaciclib可通过抑制CDK2的表达而抑制口腔癌细胞的增殖。结论:HnRNP A1-CDK2的表达水平与口腔鳞状细胞癌的生长密切相关,CDK2抑制剂(Dinaciclib)有望通过抑制hnRNP A1-CDK2信号通路而调控口腔癌的进展。

基于靶蛋白结构的CDK2小分子抑制剂研究进展

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)活性的精确调控对细胞的增殖和转录至关重要,对于一些增殖性疾病特别是恶性肿瘤,细胞的生长和增殖失控与CDKs活性异常密切相关。对CDK2蛋白结构的认识,特别是一些抑制剂与CDK2复合物的晶体学认识,极大的推动了小分子抑制剂的设计和开发。本文对一些骨架相异的有临床开发价值的小分子抑制剂与CDK2激酶的相互作用进行了解析,对激酶的各结合区特征做了归纳,进而分析了目前该领域的研究状况和趋势。

细胞周期蛋白依赖性激酶2的功能及其抑制剂的研究

细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)是CDK家族中的重要成员之一。CDK2的表达或功能异常与多种疾病(如肿瘤、病毒复制与感染、免疫缺陷性疾病和雄性不育等)发生机制密切相关。CDK2抑制剂已成为抗肿瘤药物研发中的一个重要靶点。该文对CDK2在细胞周期调控、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡中的作用机制以及CDK2抑制剂的研发进行综述。