恶性胸膜间皮瘤细胞培养条件及CDKN2B对癌细胞的作用

目的探讨不同培养条件(RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液)对人恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)组织中分离的MPM细胞传代的影响以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,CDKN2B)对MPM细胞增殖、侵袭和凋亡的作用。方法从MPM组织中分离细胞分别用RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液培养。CCK-8检测细胞增殖,细胞核及染色体利用瑞氏-吉姆萨染色观察,免疫荧光实验检测MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1荧光强度。RT-qPCR和Western blot分别检测CDKN2B的mRNA和蛋白表达能力。Transwell检测细胞侵袭能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果建立的MPM细胞在RPMI-1640、DMEM和DMEM/F12培养液中传至第10代仍具有较好的活力,且MPM标志物Calretinin、CD141、CK5、EMA和WT-1在细胞中均表达,MPM细胞在RPMI-1640培养液中活力较为稳定。CDKN2B在MPM细胞中低表达(P<0.05),过表达CDKN2B显著抑制MPM细胞的增殖(P<0.05)、侵袭(P<0.05)和上皮间质转化(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.01)。结论建立的MPM细胞可在RPMI-1640培养液中稳定传代,CDKN2B可作为MPM诊断和治疗的潜在靶标。

糖尿病肾病不同中医辨证分型患者中CDKN2A,CDKN2B,IGF2BP2和CDKAL1基因表达研究

目的:研究糖尿病肾病不同中医辨证分型的患者中CDKN2A,CDKN2B,IGF2BP2和CD-KAL1基因的表达量。方法:提取血液样本中的mRNA,并以此为模板进行反转录得到cDNA,以Real-Time PCR方法测定目的基因的表达量。结果:建立了这4个基因的定量方法,测定了50例正常人和53例糖尿病肾病患者中的基因表达量。结论:本研究在糖尿病肾病不同中医辨证分型的患者中测定了4个基因的表达量水平,对这些基因的表达量与糖尿病肾病中医辨证分型的关系进行了研究,为糖尿病肾病中医的临床诊断提供了量化指标,并同时指出基因研究对于中医中药的临床诊断和治疗具有深远的意义。

lncRNA CDKN2B-AS1对黑色素瘤B16-F10细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨长链非编码RNA CDKN2B反义RNA1(long non-coding RNA CDKN2B-antisense RNA 1,lncRNA CDKN2B-AS1)通过靶向miR-7-5p影响黑色素瘤B16-F10细胞的恶性生物学行为的影响。方法:选用黑色素瘤B16-F10细胞,构建shRNA CDKN2B-AS1载体并转染到B16-F10细胞,实验分为对照组、sh-CDKN2B-AS1组、miR-7-5p mimics组、miR-7-5p inhibitor组。用RT-PCR检测转染后B16-F10细胞中CDKN2B-AS1表达水平,用克隆形成实验和MTT法检测克隆形成数及细胞的增殖能力,用划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。用荧光素酶报告基因实验检证CDKN2B-AS1和miR-7-5p相互间靶向关系。用RT-PCR和Western blotting检测转染miR-7-5p mimics、inhibitor后B16-F10细胞中miR-7-5p和Ki67、cleaved caspase-3、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、Twist1蛋白的表达水平。结果:与对照组比较,sh-CDKN2B-AS1组B16-F10细胞中CDKN2B-AS1表达水平显著下调(P<0.01),细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著下降(均P<0.01)。荧光素酶报告基因实验证明CDKN2B-AS1与miR-7-5p存在靶向作用关系。sh-CDKN2B-AS1组与miR-7-5p mimics组细胞中miR-7-5p和cleaved caspase-3、E-cadherin水平均明显上调(均P<0.05),Ki67、N-cadherin、Twist1水平明显下调(均P<0.05)。结论:CDKN2BAS1通过靶向miR-7-5p促进黑色素瘤发展,干扰CDKN2B-AS1可抑制黑色素瘤B16-F10细胞的恶性生物学行为。

长链非编码CDKN2B调控miR-19对慢性髓细胞白血病的影响

目的:探讨长链非编码CDKN2B调控miR-19的表达影响慢性髓细胞白血病细胞的生物学行为的方式及其机制。方法:q PCR检测不同白血病细胞中CDKN2B的表达情况;双荧光素酶报告基因检测CDKN2B与miR-19的相互作用;MTT增殖实验和流式细胞检测CDKN2B对HL-60细胞增殖和凋亡的影响;划痕愈合实验检测沉默CDKN2B后白血病HL-60细胞迁移能力的变化;Transwell侵袭实验检测沉默CDKN2B后白血病HL-60细胞侵袭能力的变化;划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测沉默CDKN2B后miR-19对HL-60细胞迁移和侵袭能力的影响;鬼笔环肽染色检测沉默MEG3后细胞骨架微丝微管形态变化;Western blot检测沉默CDKN2B后PI3K/AKT信号通路蛋白的表达情况。结果:在HL-60细胞中CDKN2B表达水平最低;CDKN2B能与miR-19的3'UTR特异性结合;过表达CDKN2B可以抑制HL-60细胞增殖能力,促进其凋亡行为;沉默CDKN2B可以增强白血病HL-60细胞侵袭和迁移能力;过表达CDKN2B后细胞骨架表现为伪足减少,运动能力减弱;肌动蛋白表达水平下调;过表达CDKN2B后PI3K/AKT通路蛋白表达情况相应下调。结论:CDKN2B可以靶向调节miR-19调控白血病细胞生物学行为。

鼻咽癌组织中细胞周期相关基因CDKN2B/p15的表达及临床意义

目的探讨鼻咽癌(NPC)组织中CDKN2B/p15蛋白、mRNA的表达与肿瘤微血管密度及其临床病理特征的关系。方法90例鼻咽癌组织(病例组)、45例慢性鼻咽炎组织(对照组)中应用免疫组织化学技术检测p15蛋白表达,应用实时荧光定量RT-PCR检测p15mRNA的表达。结果p15蛋白阳性表达率鼻咽癌组织(病例组)(26.7%和35.0%)均低于于对照组(93.3%和93.2%),P均<0.01;p15的mRNA表达水平在肿瘤组中较正常组织明显降低(P<0.001);鼻咽癌组织中p15蛋白和mRNA阳性表达率Ⅲ-Ⅳ期(38.9%和44%)均低于Ⅰ-Ⅱ期(94.4%和79.2%),P均<0.05,颈部淋巴结转移者(70.4%和63%)均低于颈部淋巴结无转移者(88.9%和82.5%),P均<0.05;鼻咽癌组织中p15蛋白阳性表达组与阴性表达组MVD值无明显差异(P均>0.05)。结论p15在鼻咽癌组织中呈低表达,它与鼻咽癌病期进展和颈部淋巴结转移有一定关系,在鼻咽癌发生发展中可能起一定作用。p15可作为反映鼻咽癌生物学行为和估计患者预后的客观指标。

CDKN2A和CDKN2B区域间的基因多态性与汉族人群颅内动脉瘤性别差异性的关联分析

目的 研究CDKN2A-CDKN2B区域的基因多态性与汉族人群颅内动脉瘤(intracranial aneurysm,IA)的相关性.方法 收集500例中国汉族IA病例作为研究对象,通过病例对照的关联分析方法 和分层分析方法 ,从遗传学角度探讨存在于IA患者的性别差异与上述基因多态性是否存在关联.结果 位于9p21.3的CDKN2A-CDKN2B区域4个与血管疾病相关的SNP位点(rs1333040、rs2891168、rs2383207和rs10757278)中,rs1333040与汉族人群IA发病密切相关,其风险性主要来源于T等位基因(χ2=6.278,P=0.012,OR=1.378,95%CI 1.072~1.771).应用Logistic回归校正性别、年龄及饮酒、吸烟等危险因素后,发现rs1333040位点的T/T基因型及T等位基因是IA的独立危险因素,其患病风险率增加至1.796倍.亚组分析显示rs2891168的A/A基因型与前循环分布区的IA密切相关(P=0.025).在按性别进行统计的亚组分析中,rs1333040 T/T基因型与汉族男、女IA发病均密切相关,但与女性IA的关联程度更高.结论 遗传因素和性别在IA的发生中具有一定的影响作用.

汉族人群原发性开角型青光眼CDKN2B基因rs1063192位点基因型分布及其与rs1063192多态性的关系

目的探讨汉族人群原发性开角型青光眼(POAG)CDKN2B基因rs1063192位点基因型分布及本病与该基因位点多态性的关系。方法选取2019年5月至2021年5年江苏省海安市人民医院(以下简称“我院”)收治的98例汉族人群POAG患者为研究组,比较不同病理特征患者CDKN2B基因rs1063192位点基因型分布情况。另选取我院同期体检健康者92名作为对照组,比较研究组与对照组CDKN2B基因rs1063192位点基因型分布差异,分析CDKN2B基因rs1063192位点基因型与汉族人群POAG发病的关系。结果不同年龄、青光眼家族史情况、合并高血压情况的POAG患者CDKN2B基因rs1063192位点基因型分布比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验(P>0.05)。研究组CDKN2B基因rs1063192位点GG、AG基因型频率高于对照组,G等位基因型频率高于对照组(P<0.05)。携带GG基因型汉族人群POAG发病风险是携带AA汉族人群的3.177倍,携带G等位基因汉族人群POAG发病风险是携带A等位基因汉族人群的2.751倍(P<0.05)。结论CDKN2B基因rs1063192位点GG基因型和G等位基因可能与汉族人群POAG发病有关,可增加汉族人群POAG发病风险。

健康人群CDKN2A和CDKN2B基因甲基化水平与衰老的相关性

目的在正常人群中寻找细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKN)2A、CDKN2B基因甲基化水平与衰老之间的关系。方法我们收集了284名男性和246名女性体检者的外周血,采用甲基化特异性实时定量聚合酶链技术(qMSP)检测CDKN2A、CDKN2B基因甲基化水平。使用Pearson直线相关系数或Spearman秩相关系数来分析CDKN2A和CDKN2B基因甲基化水平与衰老的关系。结果两个基因甲基化水平之间呈正相关(P<0.05)。在总体样本组和女性组中,均发现CDKN2A基因甲基化水平与年龄呈负相关(P<0.05)。在总体样本组中,CDKN2A、CDKN2B基因甲基化水平与甘油三酯(TG)、载脂蛋白E(ApoE)、脂蛋白(a)[Lp(a)]、谷草转氨酶(AST)均呈负相关(P均<0.05)。性别分层分析后发现,女性组和男性组中两个基因甲基化水平均与Lp(a)呈负相关(P<0.05)。男性组中CDKN2A基因甲基化水平与AST呈负相关(P<0.05),而CDKN2B基因甲基化水平与高密度脂蛋白(HDL)、ApoE呈负相关(P均<0.05)。女性组中CDKN2A基因甲基化水平与低密度脂蛋白(LDL)呈正相关,ApoE、AST呈负相关(P均<0.05)。结论CDKN2A、CDKN2B基因甲基化水平与年龄以及多种蛋白指标密切相关。

抑制CDKN2B提高前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的化学敏感性

目的探究前列腺癌(prostate cancer,PCa)患者对恩杂鲁胺(Enzalutamide,Enz)化疗抵抗的机制。方法从GEO数据库中选定GSE78201表达谱,利用生物信息学筛选出导致恩杂鲁胺抵抗的候选基因。利用PCa细胞系C4-2建立恩杂鲁胺抵抗细胞系Enz-R。使用shRNA和反义寡核苷酸(ASO)在Enz-R细胞系中对CDKN2B进行敲低,通过克隆形成、MTT和细胞毒性实验检测抑制CDKN2B后Enz-R细胞对恩杂鲁胺的抗性。动物实验检测敲低CDKN2B后,恩杂鲁胺对前列腺肿瘤的治疗效果。结果CDKN2B在候选基因中表达上调最为显著,且它的上调与PCa患者的不良预后相关。敲低CDKN2B的Enz-R细胞经恩杂鲁胺处理后集落形成数目减少,生长速率减慢,对恩杂鲁胺的耐药性减弱。体内实验证明,敲低CDKN2B并使用恩杂鲁胺进行治疗,可显著抑制PCa肿瘤的生长。结论抑制CDKN2B可提高PCa细胞对恩杂鲁胺的敏感性,CDKN2B可作为PCa的潜在治疗靶点。

miR-18b靶向CDKN2B促进大肠癌细胞HCT116增殖和迁移研究

目的研究miR-18b靶向CDKN2B对大肠癌细胞HCT116增殖和迁移的作用及miR-18b与CDKN2B相关性。方法大肠癌细胞经过细胞培养、转染分为大肠癌细胞组、miR-18b沉默组、miR-18b过表达组。检测大肠癌细胞增殖、细胞周期、细胞迁移,荧光定量RT-PCR检测miR-18b、CDKN2BmRNA表达,Western Blot检测CDKN2B表达。结果miR-18b过表达组在24h、48h和72h时的大肠癌细胞增殖显著较高,48h时大肠癌细胞增殖效果最明显。miR-18b过表达组G0/G1期、S期细胞百分比较高且细胞迁移数量较高。miR-18b过表达组miR-18b表达水平高于大肠癌细胞组、miR-18b沉默组,CDKN2BmRNA低于大肠癌细胞组、miR-18b沉默组(P<0.05)。miR-18b与CDKN2BmRNA呈负相关(r=-0.708,P=0.001)。结论miR-18b过表达能增强CDKN2B表达水平,miR-18b表达上调能够促进大肠癌细胞HCT116增殖和迁移,miR-18b沉默则相反。

miR-129和CDKN2B-AS1基因多态性与云南汉族人群2型糖尿病发病风险的相关性

目的探讨微小RNA(miRNA)基因miR-129及长链非编码RNA(lncRNA)基因CDKN 2 B-AS 1中单核苷酸多态性(SNPs)与中国汉族人群2型糖尿病(T2DM)发病风险的相关性。方法746例T2DM患者作为T2DM组,同期842例非糖尿病者(NDM)作为NDM组,采用TaqMan探针法对miR-129基因中的SNPs位点rs791595及CDKN2B-AS1基因中的SNPs位点rs10811661进行基因分型,比较2个SNPs位点等位基因和基因型在T2DM组和NDM组中的分布情况;采用Logistic回归分析显性和隐性遗传模式下SNPs位点与T2DM的相关性,采用单因素方差分析2个SNPs位点的基因型与代谢指标的相关性。结果SNPs位点rs10811661等位基因频率在T2DM组和NDM组中分布差异有统计学意义,该位点等位基因C可能是T2DM的保护性因素(OR=0.851,95%CI为0.740~0.979,P=0.024),SNPs位点rs791595等位基因及基因型频率在T2DM组和NDM组中的分布差异无统计学意义(P>0.025);显性遗传模式分析结果显示,CDKN2B-AS1中的SNPs位点rs10811661基因型C/T-C/C相较于基因型TT来说可能是T2DM疾病进展中的保护性因素(OR=0.780,95%CI为0.620~0.960,P=0.021);T2DM组和NDM组中,糖脂代谢指标在SNPs位点rs791595及rs10811661的不同基因型间比较差异无统计学意义(P>0.017)。结论CDKN2B-AS1基因的SNPs位点rs10811661可能与中国汉族人群T2DM发病风险相关。

依托咪酯通过调控LncRNA CDKN2B-AS1/miR-199a-5p表达抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭

目的探讨依托咪酯对胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法用不同浓度的依托咪酯处理胶质瘤细胞U251,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测依托咪酯对U251细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测依托咪酯对U251细胞迁移及侵袭的影响;实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测胶质瘤组织中长链非编码RNA CDKN2B-AS1(LncRNA CDKN2B-AS1)与微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)的表达;采用上述方法检测抑制CDKN2B-AS1的表达或miR-199a-5p过表达对U251细胞增殖、迁移侵袭的影响;双荧光素酶报告实验验证CDKN2B-AS1与miR-199a-5p的靶向调控关系;qRT-PCR检测依托咪酯对CDKN2B-AS1与miR-199a-5p表达的影响,CDKN2B-AS1过表达以此验证依托咪酯对U251细胞增殖、迁移、侵袭的作用;Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21蛋白表达。结果与Con组相比,依托咪酯不同剂量组U251细胞抑制率显著升高,迁移与侵袭细胞数显著减少,CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低,p21表达水平显著升高,且随着依托咪酯使用剂量的增加而显著变化;胶质瘤组织中CDKN2B-AS1的表达水平显著升高,而miR-199a-5p的表达水平显著降低(均P<0.05);抑制CDKN2B-AS1的表达或miR-199a-5p过表达能够抑制U251细胞增殖、迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验证明CDKN2B-AS1可靶向结合miR-199a-5p而抑制其表达及活性(P<0.05);依托咪酯可显著提高miR-199a-5p的表达水平,降低CDKN2B-AS1的表达水平(均P<0.05);CDKN2B-AS1过表达可逆转依托咪酯对U251细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论依托咪酯可通过调控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p表达抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。

人参皂苷Rg3调控LncRNA CDKN2B-AS1对胃癌细胞抑制作用的研究

目的:探讨人参皂苷Rg3调控长链非编码RNA(LncRNA)CDKN2B-AS1对胃癌细胞的抑制作用。方法:选用胃癌细胞系SGC-7901,在培养液中加入人参皂苷Rg3的胃癌细胞确定为研究组,同时未加药物培养的胃癌细胞为对照组。培养72 h后用RT-PCR法检测细胞中LncRNA CDKN2B-AS1、神经钙粘蛋白(N-cadherin)、上皮钙粘蛋白(E-cadherin)、血管内皮生长因子(VEGF)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)与Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达水平;用免疫印迹法检测细胞中细胞外调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)、磷酸化激活的ERK1/2 (p-ERK1/2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平;用MTT试剂盒检测2组细胞的增殖抑制率;用CCK-8试剂盒检测2组细胞增殖水平。结果:与对照组比较,研究组细胞LncRNA CDKN2B-AS1、VEGF、N-cadherin、Bcl-2 mRNA及ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-9表达降低(P<0.05);Bax及E-cadherin m RNA表达升高(P<0.05);细胞增长抑制率升高(P<0.05),细胞增殖能力下降(P<0.05)。结论:在胃癌细胞的培养过程中加入人参皂苷Rg3能够有效抑制癌细胞的增殖与上皮间充质转化(EMT),为进一步临床试验提供可靠的理论基础。

细胞衰老基因CDKN2B上调与甲状腺癌侵袭性及免疫细胞浸润的关系

目的 分析生物信息学对细胞衰老相关基因(AGs)CDKN2B与甲状腺癌(TC)的侵袭性及免疫细胞浸润的关系。方法 从肿瘤基因组图谱(TCGA)得到衰老相关基因在TC组织和癌旁正常甲状腺组织中的转录表达谱进行差异分析。对表达上调的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKN)2B进行基因层面表达分析及蛋白水平层面的免疫组化分析。采用受试者工作特征(ROC)曲线对TC组织与癌旁正常组织进行鉴别。在Mexpress数据库中评估THCA患者CDKN2B mRNA表达与THCA患者临床数据的关系。使用基因本体功能注释(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因集富集分析(GSEA)对差异表达基因进行功能及通路富集分析。通过肿瘤免疫评估资源(TIMER)和肿瘤-免疫系统相互作用数据库(TISIDB)确定CDKN2B mRNA的表达与免疫细胞浸润的关系。结果 TCGA数据库分析,与甲状腺癌旁组织相比,CDKN2B mRNA在TC组织中明显高表达,在癌旁组织明显低表达(P<0.05)。ROC曲线分析得出,在CDKN2B临界值为1.945时,其敏感性、特异性和准确性分别为96.58%、84.53%和85.74%。Mexpress数据库分析显示,CDKN2B mRNA的表达与组织学类型、M分期、N分期、个人肿瘤癌症状况、性别、肿瘤分期、总生存时间差异有统计学意义(P<0.05)。GO分析表明,这些差异基因与生长因子受体信号通路和细胞衰老信号通路相关。KEGG通路富集分析主要与细胞衰老和P53信号通路相关。TIMER数据库分析,TC组织中CDKN2B表达与中性粒细胞(r=0.526,,P<0.001)、CD4^(+)T细胞(r=0.507,P<0.001)、树突细胞(r=0.437,P<0.001)、B细胞(r=0.356,P<0.001)、巨噬细胞呈正相关(r=0.335,P<0.001)。TISIDB数据库分析显示CDKN2B表达与Th1细胞、Th2细胞、中性粒细胞、未成熟树突细胞、巨噬细胞相关。免疫组化结果显示,甲状腺乳头癌(PTC)和癌旁组织中CDKN2B表达的阳性率差异显著(P<0.001)。PTC组织中CDKN2B的表达与肿瘤直径和淋巴结转移相关(P<0.05),与患者性别、年龄、腺外侵犯无关(P>0.05)。结论 CDKN2B在THCA中的高表达可能与肿瘤的侵袭和免疫浸润显著相关。

LncRNA CDKN2B-AS1对胶质母细胞瘤细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制

目的探讨LncRNA CDKN2B-AS1靶向miR-627-3p对胶质母细胞瘤细胞生物学行为和炎症反应的影响。方法采用RT-qPCR检测人正常星形胶质细胞(NHA)和胶质母细胞瘤细胞(U87、U251、LN229)中LncRNA CDKN2B-AS1和miR627-3p表达情况。分别转染si-NC、si-LncRNA CDKN2B-AS1、miR-NC、miR-627-3p模拟物、pcDNA、pcDNA-LncRNA CDKN2B-AS1、si-LncRNA CDKN2B-AS1+anti-miR-NC、si-LncRNA CDKN2B-AS1+anti-miR-627-3p至U251细胞,运用CCK-8法、克隆形成实验、Transwell实验研究U251细胞活力以及克隆形成、迁移及侵袭能力。双荧光素酶报告实验分析LncRNA CDKN2B-AS1和miR-627-3p的关系。结果与NHA细胞比较,U87、U251、LN229细胞中LncRNA CDKN2B-AS1表达量显著升高(P<0.05),miR-627-3p表达量显著降低(P<0.05)。沉默LncRNA CDKN2B-AS1或过表达miR-627-3p后U251细胞活力、克隆形成数、迁移数、侵袭数以及培养液中TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05)。LncRNA CDKN2B-AS1与miR-627-3p直接结合。抑制miR-627-3p表达显著减弱沉默LncRNA CDKN2B-AS1对U251细胞活力、克隆形成、迁移、侵袭以及炎症反应的影响。结论沉默LncRNA CDKN2B-AS1通过靶向上调miR-627-3p表达能够抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及细胞炎症反应。

TNFα诱导激活NF-κB上调抑癌基因CDKN2B表达

NF-κB通过转录调控其靶基因,在肿瘤发生发展和精准治疗中起关键作用。过表达抑癌基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)可抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡,但是否受NF-κB调节尚无报道。本文发现,NF-κB直接结合并上调CDKN2B基因:在TNFα处理的He La细胞内,CDKN2B的基因区覆盖大量NF-κB结合峰,其中富集倍数大于20的结合峰有14个。TRANSFAC软件分析发现,NF-κB结合峰内包含大量经典的κB位点。Ch IP-q PCR证明,TNFα诱导NF-κB结合CDKN2B基因。将NF-κB结合峰中心区DNA片段插入荧光素酶报告基因载体中,发现该DNA片段的插入使荧光素酶相对活性上调至7.88倍,TNFα处理又使其相对活性提高到2.37倍,且NF-κB/p65 siRNA显著干扰其相对活性的升高。免疫荧光检测显示,TNFα诱导激活NF-κB进入细胞核,而NF-κB/p65 siRNA阻止它入核。此结果提示,我们成功构建了具有NF-κB转录活性差异的细胞模型,q PCR检测两个已知的NF-κB靶基因NFKB2和STAT5A的表达,进一步验证该细胞模型构建成功。利用此细胞模型,发现受TNFα诱导激活的NF-κB,能够上调CDKN2B基因。总之,本文发现抑癌基因CDKN2B是NF-κB新的靶基因,NF-κB直接结合并上调CDKN2B基因在转录水平的表达。本研究为抑癌基因CDKN2B的抗肿瘤应用奠定了基础。

FTO通过调控CDKN2B mRNA中m6A修饰促进子宫内膜癌细胞增殖的初步研究

目的:探索FTO基因在子宫内膜癌组织样本中的表达及调控子宫内膜癌细胞的增殖能力。明确下游关键靶基因及其作用机制。方法:通过定量PCR、组织芯片、免疫组织化学等方法探索FTO基因与蛋白在子宫内膜癌组织中的表达。细胞培养、CCK-8与裸鼠成瘤实验探索FTO调控子宫内膜癌细胞增殖能力。RNA免疫沉淀、甲基化RNA免疫沉淀、转录组测序等方法探索FTO基因发挥作用的可能机制。结果:FTO在子宫内膜癌组织中表达增加(P<0.001),并且高表达FTO的患者预后更差(P=0.007)。FTO可以促进子宫内膜癌细胞增殖及裸鼠成瘤。敲低细胞内FTO表达后,转录组测序联合GO与KEGG分析显示负调控细胞增殖与细胞周期抑制等相关通路被富集。细胞周期抑制基因CDKN2B mRNA表达水平(P<0.001)、m6A修饰水平(P=0.003)及蛋白表达水平明显增加。结论:FTO在子宫内膜癌中表达增加,其机制可能是通过抑制m6A修饰负调控细胞周期抑制基因CDKN2B,加速肿瘤细胞增殖。

汉黄芩素调控lncRNA CDKN2B-AS1抑制宫颈癌细胞生长

目的探究汉黄芩素对宫颈癌细胞生长的作用机制。方法体外培养宫颈癌细胞株HeLa并分为对照组、低浓度组(汉黄芩素40μmol/L)、中浓度组(汉黄芩素80μmol/L)、高浓度组(汉黄芩素120μmol/L),采用MTT检测细胞增殖,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,采用蛋白免疫印迹法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Survivin蛋白表达量,采用RT-PCR法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Survivin、lncRNA CDKN2B-AS1 mRNA表达变化。结果24 h、48 h、72 h时,低浓度组、中浓度组和高浓度组中宫颈癌细胞增殖指数、LncRNA CDKN2B-AS1 mRNA表达均低于对照组(P<0.05),有浓度依赖性。24 h时,高浓度组、中浓度组和低浓度组细胞凋亡率均高于对照组(P<0.05),有浓度依赖性;高浓度组Bax、Caspase-3蛋白和mRNA表达量高于对照组,Survivin、Bcl-2蛋白和mRNA表达量低于对照组。结论汉黄芩素可抑制宫颈癌细胞HeLa细胞增殖、促进其凋亡,还可抑制lncRNA CDKN2B-AS1表达。

miR-125a-5p靶向调控CDKN2B表达抑制肝癌细胞的增殖和转移

[目的]探讨miR-125a-5p在肝癌细胞中的表达,及其对肝癌细胞增殖和转移的影响。[方法]采用荧光实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测肝癌组织与癌旁组织中miR-125a-5p与细胞周期依赖蛋白激酶抑制因子2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,CDKN2B)的表达水平;通过向肝癌细胞HepG2细胞系中转染miR-125a-5p mimic和inhibitor干扰内源miR-125a-5p的表达,同时检测其靶基因CDKN2B蛋白的表达变化;采用CCK-8法检测各组肝癌细胞增殖能力的变化,以及划痕实验对HepG2细胞迁移能力进行评估。[结果]在肝癌患者中,肝癌组织中miR-125a-5p的表达水平(2.16±0.37)显著高于癌旁组织(1.28±0.21),差异有统计学意义(P<0.05);肝癌组织中CDKN2B的表达水平(0.87±0.15)显著低于癌旁组织(1.56±0.28),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。在32例肝癌患者肝癌组织中,CDKN2B表达水平与miR-125a-5p表达呈显著负相关(r=-0.168,P<0.05);HepG2细胞体外转染实验结果发现,降低细胞内源miR-125a-5p的表达时,CDKN2B表达水平显著升高,细胞的增殖活性以及转移能力会被抑制;而上调细胞内源miR-125a-5p的表达时,CDKN2B表达水平显著下降,细胞的增殖活性与转移能力显著提高,相比于对照组差异有统计学意义(P<0.05)。[结论] miR-125a-5p在肝癌组织中高表达,其可能靶向调控CDKN2B的表达抑制肝癌细胞的增殖活性与转移能力,在肝癌的发生发展过程中起着重要的生理功能。

lncRNA CDKN2B-AS1靶向miR-98-5p对肺癌A549细胞增殖、侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)CDKN2B-AS1靶向miR-98-5p对肺癌A549细胞增殖、侵袭的影响。方法体外培养肺癌A549细胞,分为对照组、pcDNA组(转染pcDNA)、CDKN2B-AS1组(转染pcDNA CDKN2B-AS1)和双转染组(转染pcDNA CDKN2B-AS1、pcDNA miR-98-5p)。检测A549细胞中CD-KN2B-AS1、miR-98-5p表达及PCNA、MMP-9蛋白表达,检测A549细胞活性、克隆数、克隆形成率、侵袭细胞数。结果与pcDNA组相比,CDKN2B-AS1组A549细胞中CDKN2B-AS1表达水平[(2.14±0.14)vs(1.03±0.10)]、各时间点的细胞OD值、细胞克隆数[(314.60±18.13)个比(220.08±12.46)个]、克隆形成率[(85.81±3.06)%vs(60.03±2.85)%]、侵袭细胞数[(233.30±18.98)个vs(140.84±12.30)个]及细胞中PCNA[(0.78±0.08)vs(0.48±0.07)]、MMP-9蛋白表达[(0.75±0.06)vs(0.38±0.06)]水平显著升高(均P<0.05),miR-98-5p表达水平[(0.23±0.03)vs(0.99±0.09)]显著降低(P<0.05);与CDKN2B-AS1组相比,双转染组A549细胞中CD-KN2B-AS1表达水平差异无统计学意义(P>0.05),miR-98-5p表达水平显著升高(P<0.05),各时间点的细胞OD值、细胞克隆数、克隆形成率、侵袭细胞数及细胞中PCNA、MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论lncRNA CDKN2B-AS1通过靶向抑制miR-98-5p表达对肺癌A549细胞增殖、侵袭具有促进作用。