中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析

报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定.利用RT-PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6 RNA聚合酶启动子之后,基因组3'末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆.该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增.经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到107～108pFU/ml.全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8 453位核苷酸由C变为T)产生Xba Ⅰ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在.从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆.该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具.

中国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长cDNA克隆及序列测定

从中国人源蓝氏贾第虫北京株 ( BEIJ88/ BTMR1/ 1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中 ,感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了 6对互相重叠的引物。用这 6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行 RT- PCR,将产物连接到 p MD18- T载体中并转化入 DH5 α感受态菌 ,送上海生工测序 ,通过 BL AST对 Gen- Bank进行同源性搜索。结果测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长为 6 2 73bp,与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为 95 % ,编码的氨基酸同源性为 90 %。

欧洲型PRRSV弱毒株全长基因组cDNA克隆的构建与分析

为了获得欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,通过RT-PCR技术扩增了AMERVAC-PRRS/A3弱毒株的全基因组,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择合适的酶切位点将各个亚克隆产物逐段克隆入改造过的pBluescriptⅡKS(+)载体中,从而获得了病毒的全长基因组cDNA克隆。测序结果表明,该弱毒株基因组序列全长为15 098 bp(不包括poly(A)尾)。同源性比较结果显示,Ningbo42株ORF7基因(EF473137)、FJ0603株Nsp2基因(EF592535)与该弱毒株的相应基因之间的同源性分别为100%和98%。这些数据暗示,国内欧洲型PRRSV Ningbo42株和FJ0603株的存在与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3密切相关。测序及酶切鉴定结果表明,欧洲型PRRSV全长基因组cDNA克隆已构建成功。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株基因组全长cDNA克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)嗜好在PAM和其他单核细胞上生长 ,如果把PRRSV作为一种病毒活载体 ,它就可以携带外源抗原高效进入猪体的免疫系统 ,更好地刺激机体产生免疫应答。本实验根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点 ,将PRRSV基因组设计为 8段进行了反转录和扩增 (RT_PCR) ,将得到的片段克隆到质粒pBluescriptIISK(_)或pMD 18T_vetcor中。在扩增 5’端时 ,运用 5’RACE获得了基因组 5’最末端序列 ,在亚克隆入pOK12前在 5’端上游引入了T7启动子序列。选取一个克隆在 3’端紧挨ORF7下游引入了PacⅠ位点 ,以期作为感染性分子克隆的分子标志。将扩增片段在pBuescriptIISK(_)中进行了部分连接后 ,亚克隆于低拷贝质粒pOK12中 ,在pOK12中进行了长片段的连接 ,并获得了基因组全长cDNA克隆。进行全基因测序后 ,在 3处发现有 6个核苷酸的缺失 ,运用插入突变修补丢失的碱基 ,最终获得了含有PRRSVCH_la株基因组全长cDNA的重组质粒pOKCH_laF和含有分子标志PcaⅠ的基因组全长cDNA克隆pOKCH_laPacIF。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6.5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT-PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F/HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmB I将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基插入突变成功,F/HN基因区域碱基突变均得以纠正。以上cDNA克隆的修饰与替换为该毒株的反向遗传研究打下了基础。

玉米ST和ATPS部分cDNA序列克隆及分析

硫酸盐转运蛋白(ST)和ATP硫酸化酶(ATPS)是根系吸收硫酸盐和植物体内硫酸盐同化过程的关键蛋白和酶,在硫酸盐的生物转运过程中具有重要作用.以水培玉米农大108根系为材料,并根据已报道的玉米的硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶基因保守序列分别设计PCR引物对,采用RT-PCR方法克隆到783 bp和820 bp的部分硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶cDNA片段,分别命名为ST_ND108和ATPS_ND108.序列分析和比对结果显示,ST_ND108与已报道的玉米和水稻的高亲和型硫酸盐转运蛋白基因同源性分别为99%和85%;而ATPS_ND108与已报道的玉米ATP硫酸化酶基因同源性达到97%,进化树聚类分析和预测氨基酸的BLAST结果证实ST_ND108为高亲和性硫酸盐转运蛋白基因片段,ATPS_ND108为质体ATP硫酸化酶基因片段.

串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。

法克隆紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶全长cDNA(英文)

4 香豆酸 :CoA连接酶 (4CL)是木质素生物合成过程中重要的酶 .该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法直接获得了紫穗槐 4CLAcDNA全长序列 ,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程 .先用简并PCR得到了 4CLA1片段 ,又据此片段设计反向嵌套引物 ,用RACE方法获得未知的 5′和 3′端序列 .所获得的全长 4CLAcDNA ,编码 5 40个氨基酸 .氨基酸序列同源性分析表明4CLA是典型的 4CL蛋白 ,含有预计的AMP binding位点、催化反应区和保守的Cys .

SSH和“越轨”RACE分子克隆技术

SSH和“越轨”RACE(stepoutRACE)均为创建于PCR抑制作用基础上的cDNA基因克隆新技术。SSH具有真阳性率高、不同丰度的mRNA都能被有效分离等优点 ,“越轨”RACE具有高灵敏度、低背景、操作简便等长处 ,这两项技术现已经成功应用于大量EST的分离、减数cDNA文库的构建、差别表达新基因的分离 。

发育特异基因及其在RNA水平上的表达

从λ噬菌体gt11的cDNA表达文库筛选到7个胡萝卜体细胞发育特异的基因克隆,并对它们进行了纯化、分离噬菌体DNA,限制酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定,以及将cDNA插入片段再克隆到pIBI或p^(UC18)质粒等处理。然后,通过Southern blot分析,证明克隆16,22,50及60等为新的cDNA基因。此外,又通过Northern blot分析测定了这些基因的组织特异性表达及时序表达。结果表明,克隆22是一种受发育调节,与胡萝卜体细胞胚胎形成密切相关的基因。

肠道病毒71型武汉分离株(EV71-WH029)全基因组cDNA克隆及序列分析

目的对肠道病毒71型武汉分离株（EV71-WH029）进行全基因组克隆、序列测定及分析,了解其基因组结构和遗传进化特征,并初步探索EV71毒力相关位点。方法采用RT-PCR扩增覆盖基因组全长的cDNA片段,利用Over-lap extension PCR得到WH029全基因组cDNA克隆;cDNA片段测序后利用BioEdit 4.8.8和MEGA 5.2.2等软件进行序列分析和遗传进化分析;采用Fisher＇s exact test进行编码区氨基酸变异位点的统计分析;采用RNAfold服务器进行非编码区二级结构分析。结果 WH029分离株基因组全长7 406nt（未包含多聚腺苷酸尾）,5′-和3′-UTR分别为743nt和81nt,中间为一个全长6 582nt开放阅读框（ORF）,编码一个长度为2 194aa的多聚蛋白,编码区无核苷酸的缺失或插入;该毒株与安徽阜阳株EU703813及上海株JQ736684的核苷酸及氨基酸序列同源性均最高（分别为97.53%-100%和97.41%-99.73%）,系统进化分析也表明该毒株与以上两株的亲缘关系最近;编码区氨基酸序列分析发现有7个位点变异。非编码区的二级结构预测提示,该区域的核苷酸位点变异与毒力无直接相关性,而与地域有相关性。结论 WH029分离株全基因组结构符合EV71病毒特征,经序列比对及进化分析证实WH029分离株属于EV71C4a基因亚型,并推断该株可能来源于2008年安徽HFMD疫情。对不同临床症状的EV71毒株序列的比较分析提示,EV71毒力与编码区单一位点的突变及非编码区二级结构的变异无直接相关性,可能与多位点突变共同作用及患者的个体差异相关。

新型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株全长cDNA克隆的构建与分析

为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(EF635006)和经典CH-1a株(AY032626)全基因组序列设计并合成特异引物,进而用RT-PCR分6段扩增了HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到pMD20-T载体中,建立了PRRSV弱毒株的初级cDNA克隆,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择特异的酶切位点,将各个亚克隆产物逐段亚克隆入经过改造的低拷贝pOK12载体中,通过引入MluⅠ和EcoRⅠ酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ和T7启动子序列及榔头锤酶基因置于病毒基因组的5′端,引入NotⅠ和FseⅠ将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列及戊型肝炎病毒核酶基因置于病毒基因组的3′端,结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆ppAPRRSVOK12。测序结果表明,该毒株基因组全长15 319bp[不包括poly(A)尾];全基因序列比对结果显示,该毒株属于北美洲型毒株,与HuN4的同源性高达99.5%。测序及酶切鉴定结果证实,HP-PRRSV弱毒株基因组全长cDNA克隆已构建成功。

一种新的柯萨奇病毒A组16型中国湖北分离株(CV-A16WH16)全基因组序列测定及分析

目的对分离自2010年中国湖北手足口患者的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)病毒WH16株进行全基因组克隆、序列测定及进化分析。方法利用RT-PCR扩增覆盖基因组全长的cDNA片段,利用Over-lap PCR进行分步连接,得到CV-A16 WH16的全基因组cDNA克隆。对cDNA克隆进行测序,并利用BioEdit 4.8.8、EditSeq 5.01和MEGA 6.06软件进行序列分析和进化树构建。结果CV-A16 WH16基因组(未包含多聚腺苷酸尾)长度为7 406nt;WH16与CV-A16TS10/07、CV-A16原型株G-10以及EV71原型株BrCr的核苷酸一致性分别为97.7%、79.1%和79.5%,而氨基酸一致性分别为98.9%、94.7%和88.7%。全基因组进化树分析表明,CV-A16 WH16与CV-A16TS10/07亲缘关系最近,与G-10株存在显著差异;开放阅读框核苷酸序列进化树分析表明,CV-A16 WH16与EV71BrCr的亲缘关系较近。结论进化树分析表明,与G-10相比,CV-A16 WH16部分区域的核苷酸序列和BrCr的亲缘关系更近。