茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库,经蓝白斑筛选共得到121个含有插入片段的阳性克隆。通过菌落PCR的方法分别对阳性克隆的插入片段进行扩增,结果表明,95％左右阳性克隆插入片段的大小在200-600 bp之间。随机选取25个克隆进行测序,并对所得的25条表达序列标签(EST)序列用Blastn(基本局域联配搜寻工具)检索基因文库(genbank),其中10条EST片断可找到碱基序列相似性大于80％以上的同源基因序列,其余15条EST为没有任何功能线索的未知序列。外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建和在此基础上克隆橡胶树胶乳中JA信号的候选应激基因,将为开展茉莉酸调控橡胶树胶乳代谢和橡胶生物合成的分子机理研究打下基础。

+Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库的构建

目的应用抑制性消减杂交技术构建 +Gz重复暴露大鼠脑和正常大鼠脑差异表达的cDNA消减文库 ,为筛选 +Gz暴露大鼠脑差异表达基因 ,探讨 +Gz引起脑损伤的分子机制奠定基础。方法Wister大鼠随机分成对照组和 +Gz重复暴露组 ,对照组大鼠G值为 + 1Gz,实验组大鼠在动物离心机上经历了 3次+ 1 0Gz/1min(两次间间隔 30min)作用 ,于暴露后 6h处死取脑。分别从 +Gz重复暴露组和对照组大鼠脑中提取poly(A) +RNA ,依次合成单链及双链cDNA ,用RsaⅠ酶切成大小不等的片段。将 +Gz重复暴露组cDNA分为两组 ,分别与两种不同的接头连接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将PCR产物与T/A载体连接构建 +Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库。结果成功构建具有高消减效率的 +Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库 ,非特异性cDNA片段被有效地消减 ,特异表达的cDNA得到富集。结论 +Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库的建立为进一步筛选、克隆 +Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因奠定了基础。

新生猪磨牙牙根发育cDNA消减文库的建立

目的 :分析新生猪前后牙基因的表达差异并获取新的表达序列。方法 :以新生猪第一恒磨牙牙胚为检验方 ,恒中切牙牙胚为驱动方 ,进行消减杂交 ,经克隆筛选获得新生猪恒磨牙的消减文库。结果 :随机挑选出 6 0个阳性克隆 ,酶切后获得 2 0 0～ 2 0 0 0bp的插入片断。结论

申克孢子丝菌菌丝相和酵母相cDNA消减文库的构建及差异表达基因的筛选

目的构建申克孢子丝菌双相cDNA消减文库,筛选与双相转换相关的差异表达基因。方法运用抑制性消减杂交技术,构建申克孢子丝菌菌丝相(Mycelium,M)和酵母相(Yeast,Y)的正反cDNA消减文库,并对其差异表达的基因进行生物信息学分析。结果 M+Y文库获得751条表达序列标签(Expressed Sequence Tags,ESTs),经拼接后获得101条uni-genes;Y+M文库获得875条ESTs,拼接获得249条unigenes。申克孢子丝菌酵母相菌丝相的转换伴随着不同菌相细胞差异基因的高表达,这些高表达的差异基因可分为结构基因类、代谢酶类、细胞表面分子类及功能不明的细胞分子。结论成功构建了申克孢子丝菌双相转换相关的cDNA消减文库基础上,筛选出部分差异表达基因,为进一步研究申克孢子丝菌致病相关基因奠定了基础。

肾癌相关基因克隆——肾癌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术 ,构建人肾癌与正常肾差异表达的cDNA消减文库 .分别从肾癌及正常肾细胞系中提取 poly (A) +RNA ,依次合成单链及双链cDNA ,经酶切成平均大小为 4 0 0～ 60 0bp的片段 ,将肾癌cDNA分为两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与正常肾cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后 ,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 .构建成功具有高消减效率的人肾癌cDNA消减文库 ,非特异性cDNA片段被有效地消减 ,特异表达的cDNA得到富集 .文库扩增后得到 650 0个克隆 ,随机挑取 3 50个制备质粒 ,酶切分析均得到 4 0 0～ 60 0bp插入片段 .所构建的人肾癌cDNA消减文库为进一步大批量筛选。

构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库

目的 :构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库。方法 :将不稳定型心绞痛病人 (n =15 )和稳定型心绞痛病人 (n =15 )的淋巴细胞的RNA进行抑制性消减杂交 (SSH) ,将获得的顺向和逆向消减产物分别与T/A载体连接 ,采用 1×TSS一步法转化大肠杆菌JM10 9,获得消减cDNA文库 ,采用蓝白斑筛选和菌落PCR筛选有插入片段的克隆。结果 :各组cDNA文库各获得 2 0 0 0个阳性克隆 ,cDNA片段大部分分布于 ( 2 0 0 - 6 0 0 )bp之间。结论 :本研究构建了不稳定型心绞痛淋巴细胞消减cDNA文库 。

皱纹盘鲍外套膜耐维生素E缺乏消减cDNA文库的构建

为了克隆维生素E缺乏时皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)外套膜差异性表达的基因,本研究配制了维生素E缺乏水平(3.5 mg/kg)和正常添加水平(52.8 mg/kg)的人工饲料,喂养皱纹盘鲍幼鲍,初始体质量为(0.71±0.00)g,初始壳长为(15.49±0.04)mm,240 d后,采用抑制消减杂交法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建了维生素E缺乏组与正常组外套膜组织差异表达的cDNA消减文库。经检验,差异表达的基因均被富集了25-28倍,证明构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率。从文库中随机挑取100个白色克隆摇菌液进行PCR鉴定,95%的克隆中均有100-900 bp的插入片段,这些片段可能是维生素E缺乏差异表达基因的cDNA片段。选取含插入片段大小不同的48个克隆测序,其中有16个新基因,10个谷胱甘肽转移酶的基因,5个谷胱甘肽过氧化物酶基因,2个过氧化氢酶基因,3个羟基类固醇脱氢酶基因,4个酪氨酸激酶基因,1个类甲状腺过氧化物酶蛋白基因,3个纤维素酶基因,1个cAMP效应元件结合蛋白基因,3个贝壳生物矿化相关蛋白的基因。总的来说,利用抑制消减杂交的方法构建差异表达cDNA文库,可以比较好地反映维生素E对皱纹盘鲍影响的基因信息,为研究其他营养素对皱纹盘鲍基因表达的影响提供了基础数据。

梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库的构建

以梅山猪和长白猪的背最长肌为材料 ,利用抑制性消减杂交技术成功构建了梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库。以管家基因G3PDH作为消减指标 ,检测梅山猪和长白猪两个消减文库的消减效率分别高达 2 10 和 2 5倍 ,表明某些特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率也分别接近 2 10 和 2 5倍。从两个消减文库中分别筛选到了 70 9和 6 73个有效阳性克隆 ,PCR鉴定插入片段长度主要分布于 15 0～ 75 0bp之间。不同猪种肌肉组织间消减cDNA文库的构建为进一步分离和鉴定与猪肌肉生长和肉质相关基因奠定了基础 ,对探讨肌肉生长机理和肉质决定因素以及猪的分子育种具有重要意义。

刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)研究刺参高温胁迫下差异表达的基因。分别以高温实验组为检测组(tester)、常温对照组为驱动组(driver),进行正向抑制性消减杂交;以常温组为tester、高温组为driver,进行反向消减杂交,成功构建了刺参正反双向差异消减文库。从两个文库随机挑选384个白斑克隆进行斑点杂交进一步筛选,对其中差异显著的50个克隆进行测序分析。测序结果经BLAST比对分析得出:44个克隆与已知基因序列高度同源,主要包括3个上调表达基因和2个下调表达基因;另外5个克隆为未知新基因序列。该消减文库的成功构建对刺参耐高温相关基因的深入研究以及阐述耐高温的分子机理有非常重要的意义。

三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验，差异表达基因均被富集了2^10倍左右，证明构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率。PCR鉴定发现，在随机挑取的阳性克隆中，95％的克隆均含有0．2～1．0kb的插入片段，这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得214个有效cDNA序列，分别属于8大类，共98个基因。其中细胞分裂基因2个、细胞结构与运动基因9个、代谢基因10个、信号传导基因7个、细胞防疫基因10个、基因与蛋白表达基因20个、未知功能蛋白基因26个，GenBank中找不到任何同源序列的基因14个。结果说明，构建的差异表达cDNA文库，可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。

福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建

【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg·kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。

刚地弓形虫强弱毒株速殖子抑制消减cDNA文库的构建和初步分析

为筛选刚地弓形虫的毒力相关基因,以弓形虫为研究对象,构建了弓形虫强弱毒株抑制消减cDNA文库。分别收集弓形虫Ⅰ型RH株和Ⅱ型QHO株速殖子,提取总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA。用抑制消减杂交技术(SSH)构建弓形虫强弱毒株正向消减(弱毒株消减强毒株)及反向消减(强毒株消减弱毒株)cDNA文库。从两文库中各筛选10个阳性克隆测序及进行在线BLAST分析。结果显示,构建的弓形虫强弱毒株的消减cDNA文库具有较强的特异性;在获得的18个有效表达序列标签中,有12个与已报道的基因有较高相似性,另外6个可能代表新基因。表明,弓形虫强弱毒株差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究弓形虫毒力相关基因的功能奠定了基础。

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础.试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(ETA-Fe2+,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2+,40μmol/L)的根的总RNA,经过LD-pCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库.用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300～800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果.

猪蛔虫感染期幼虫抑制消减cDNA文库的构建

为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。

一种用少量标本快速构建老年性白内障消减cDNA文库的方法

为从少量标本中获得含较多大片段的、高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用磁珠分离、生物素标记的改良消减杂交法获得差异cDNA ,利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,从而成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .在文库中随机挑取的 2 2个克隆中 ,10 0 0bp以上的片段有 7个 ,占 31 8% ,75 0bp以上有 15个 ,占 6 8 2 % .所得cDNA片段较大 ,可以满足下一步研究需要 .

蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因,研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析,获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank和GenBank EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪(P<0.05);GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪(P<0.05)。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性,这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著(P<0.05)。

C57BL/6小鼠感染猪链球菌2型后脾脏消减cDNA文库的构建及差异基因分析

探讨C57BL/6品系小鼠体内猪链球菌2型感染后的差异表达基因,以期为进一步研究猪链球菌的致病机制和抗病性研究提供重要的参考依据。利用抑制性消减杂交技术构建了8周龄C57BL/6小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库。对获得的237个阳性克隆进行测序,利用GenBank BLAST分析核酸和蛋白质同源性,共获得159条差异表达序列标签(ESTs)。试验结果证实,正向文库有34个、反向文库有30个不同的基因与ESTs具有高度的同源性,它们分别是免疫性能、细胞组分、细胞信号分子、转录因子等的重要功能基因产物。经抑制消减杂交筛选出的差异表达基因主要有免疫球蛋白IgM重链-6、胸腺素4-beta、磷酸酶张力结合蛋白、转磷酸胆碱酶、肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶、磷脂酰丝氨酸脱羧酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-3等基因。筛选到较多EST与抗病性相关的重要基因具有很高的同源性,且这些基因在猪链球菌2型感染后的表达具有显著差异,提示这些基因在猪链球菌2型感染过程中发挥着重要功能。

‘津田’芜菁消减cDNA文库的构建及分析

以‘津田’芜菁红色块根和白色块根为材料，利用SSH技术成功构建了消减cDNA文库并富集相关基因片段。从消减文库中筛选到960个阳性克隆，PCR鉴定插入片段长度主要分布于300～800bp之间。克隆测序后与GenBank中的同源序列进行比较，特异基因片段为302个，其中99个与数据库中的序列具有相似区域且功能已知，与数据库中序列没有显著同源性及功能未知的序列为203条。

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选。

A/J小鼠感染猪链球菌2型后脾脏消减cDNA文库的构建及相关差异基因表达分析

为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。