以CDNB为探针测定大鼠肝微粒体中GST活性并优化反应体系

目的以1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)为探针,优化大鼠肝微粒体中谷胱甘肽硫转移酶(GST)催化反应的条件,为准确测定GST活性提供依据。方法采用Welch Materials Ultimate TM XB C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(7∶3),流速0.8 mL.min-1,检测波长238 nm。首先于0.05 mg.mL-1蛋白浓度下,孵育10 min,检测CDNB能否被GST催化发生反应,然后分别在CDNB及CDNB+GSH两种反应条件下,比较不同浓度蛋白、孵育时间、底物浓度的反应差异,选出合理反应条件。结果 CDNB在选定色谱条件下实现了快速分离,且无内源性干扰。CDNB在GST催化下发生了反应;在不同浓度蛋白、孵育时间、底物浓度下,两种反应条件下CDNB反应存在明显差异(P<0.05):CDNB及GSH作为起始条件时反应较少,此外,CDNB反应量与蛋白浓度、孵育时间分别呈线性关系,是优化反应条件的重要依据。结论采用CDNB测定GST活性时,选择合适的CDNB及GSH反应条件能准确地测定GST活性,可用于GST活性测定及相关动力学分析。

烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17的鉴定及表达特性分析

为研究烟草谷胱甘肽转移酶(GSTs)的功能,采用同源搜索的方法从NCBI数据库中找到1个烟草GSTs类似基因,通过聚类分析、体外活性分析对该基因及其表达产物进行鉴定;打顶和农药(代森锰锌、百草枯)处理烟草后,运用荧光实时定量PCR技术对该基因的表达特性进行分析。结果表明:该基因是tau类GST基因,命名为Nt GSTU17,其编码区长666 bp,编码221个氨基酸;该基因编码产物对谷胱甘肽转移酶通用底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-Chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)具有较高的偶联活性;Nt GSTU17基因在烟草中为组成型表达,但在根中的表达量要低于地上部分的表达量;打顶对该基因的表达有一定上调效应;代森锰锌处理烟草后在短期内能快速、显著上调Nt GSTU17基因的表达,而百草枯处理烟草后则能显著抑制根中Nt GSTU17的表达,表明Nt GSTU17基因可能参与烟草的胁迫应答反应,并对不同农药的胁迫表现出选择性。

柱前衍生反相高效液相色谱法分析赖氨酸

采用２、４－二硝基氯苯（ＣＤＮＢ）作为柱前衍生化试剂，Ｃ(１８)为分离柱，选用甲醇和 ＨＡＣ－ＮａＡＣ缓冲液为流动相．此缓冲液与甲醇配比为８０：２０，其ＰＨ值为５.２７，在此条件下测得 赖氨酸（Ｌｙｓ）与邻近四种氨基酸分高效果较好。

竹炭对溶液中2,4-二硝基氯苯的吸附与回收研究

本研究了竹炭对溶液中2,4-二硝基氯苯(CDNB)的吸附行为。研究确定竹炭对CDNB的吸附平衡时间、最佳吸附pH以及吸附温度、吸附剂用量等因素对吸附效果的影响。实验结果表明:CDNB初始浓度c0=0.05mg/mL,T=298K,pH=5.0,吸附时间t=12h时,竹炭对CDNB的吸附率E可达到97.6%;用乙醇作洗脱再生剂,洗脱率可达95.2%;且脱附的CDNB可用蒸馏重结晶法回收,回收率可达86.4%。因此,竹炭是废水中CDNB吸附处理的材料。

3种硝基苯污染物对锦鲤鱼的急性毒性

采用静水生物测试研究了对氯硝基苯(P-NCB)、间二硝基苯(M-DNB)和2,4-二硝基氯苯(CDNB)对锦鲤鱼的急性毒性。以锦鲤鱼(Brocarded Carp)为试验生物,将其暴露于3种化合物不同浓度的试液中,通过鱼类的死亡率求出96 h半数致死浓度(LC50)。试验结果表明,对氯硝基苯、间二硝基苯、2,4-二硝基氯苯96 h LC50分别为22.13、14.53、0.692 mg.L-1。对氯硝基苯、间二硝基苯和2,4-二硝基氯苯对锦鲤鱼的急性毒性顺序为2,4-二硝基氯苯>间二硝基苯>对氯硝基苯,3种化合物的安全浓度分别为2.213、1.453和0.069 2 mg.L-1,2,4-二硝基氯苯对锦鲤鱼的安全浓度低于地表水环境标准,间二硝基苯和对氯硝基苯安全浓度高于标准限值。

柱前衍生-高效液相色谱法测定大熊猫血清中18种游离氨基酸

建立了大熊猫血清中18种游离氨基酸的反相高效液相色谱分析方法。血清样品经HPO3沉淀蛋白后,在弱碱性条件（pH 9.0）下游离氨基酸与2,4-二硝基氯苯在90℃水浴中避光反应1.5 h,生成具有紫外吸收的衍生物,用反相C18柱分离,紫外检测器检测,内标法定量。18种氨基酸的工作曲线的相关系数范围为0.9951～0.9999;相对标准偏差为1.4%～4.7%;检出限为0.20～7.72μg/mL;加标回收率为65.9%～118%。

2，4－二硝基氯苯衍生化法在反相高效液相色谱测定氨基酸中的应用研究

研究了采用２，４－二硝基氯苯（ＣＤＮＢ）作衍生化试剂，用于反相高效液相色谱（ＲＰ－ＨＰＬＣ）测定氨基酸的方法。衍生化反应条件为在碱性溶液中８０℃１小时，制得１７种ＤＮＰ－氨基酸。采用甲醇－醋酸盐缓冲系统梯度洗脱，５０分钟内大多数氨基酸可较好地分离。衍生化产物性质稳定，３６０ｎｍ波长处紫外检测，１７种氨基酸的最低检出限为２μｇ。

玉米螟谷胱甘肽转硫酶的纯化及性质研究

以亚洲玉米螟（Ｏｓｔｒｉｎｉａｆｕｒｎａｃａｌｉｓ）为材料，经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）为配基的亲和层析，分离纯化得到玉米螟谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）。以２，４二硝基氯苯（ＣＤＮＢ）为底物测得其比活为１０７０Ｕ／ｍｇ蛋白，收率为２２９％，提纯１１３８倍。经ＳＤＳＰＡＧＥ和ＰＡＧＥ鉴定，得到的ＧＳＴ为一条带，亚基的分子量为２５ｋＤ，经凝胶过滤测得其全酶分子量为５０ｋＤ，说明该酶是由两个相同亚基组成的。ＩＥＦ测得主带等电点为８２。该酶最适温度为４１℃，最适ｐＨ范围为６３～６９。经动力学测定该酶双底物反应机制为序列机制，对ＣＤＮＢ的Ｋｍ值为０１５ｍｍｏｌ／Ｌ，对ＧＳＨ的Ｋｍ值为０３５ｍｍｏｌ／Ｌ，两种底物的ｋｃａｔ均为７８３ｓ－１。Ｃｌ－对底物ＣＤＮＢ有竞争性抑制作用，对ＧＳＨ是非竞争性抑制作用；３，５二硝基苯甲酸（ＤＮＢ）对ＣＤＮＢ有竞争性抑制作用，对ＧＳＨ是反竞争性抑制作用。

2,4-二硝基氯苯洗涤废水资源化研究

采用活性炭吸附-碱液脱附法无害化处理2,4-二硝基氯苯[CDNB]生产中的废水,使CDNB的含量降到0.5 mg/L以下,达到国家地表水一级排放最高含量0.5 mg/L的标准(GB 3838-2002).活性炭可以反复再生,重复利用,处理废水成本由10元/t降低到2元/t以下.将CDNB转化成2,4-二硝基苯酚[DNP]进行回收,既避免了二次污染,又变废为宝.