含Egr-1启动子和Smad7基因的重组腺病毒的构建

目的 :构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并初步验证其活性 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法 :以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,再将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,然后与腺病毒DNA重组 ,转化大肠杆菌E .coliDH5α ,PCR鉴定正确即为pAdES。脂质体法转染HEK2 93细胞 ,包装出完整腺病毒 ,然后大量扩增测定滴度。重组腺病毒感染成纤维细胞 (3T6 ) ,经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad7蛋白在细胞内的表达定位。结果 :经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 1.0× 10 11TCID50 /ml。细胞免疫化学结果显示Smad7蛋白表达定位于细胞质内。结论 :利用Adeno XTM 表达试剂盒 ,通过分子克隆体外重组技术可以方便的构建重组腺病毒载体 ,并能在HEK2 93细胞内成功包装和扩增。

PDL7-360ES型平台车发动机奇特的故障现象与技术改造

一辆日本神钢电机株式会社制造的PDL7—360ES型平台车,在使用中给用户带来了不应有的损失,迫使笔者不得不对其有关结构进行研究。通过研究揭示出了其发动机在结构上存在的缺陷,据此获得了必要的经济赔偿及有关零部件,并且完成了必需的技术改造。本文介绍该平台车发动机奇特的故障现象和技术改造方法。