酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶基因(cct)的克隆表达及活性测定

以酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)基因组DNA为模板,克隆并表达了编码磷酸胆碱胞苷转移酶的基因cct。根据NCBI提供的序列信息,设计扩增cct基因的引物,经PCR扩增、酶切后,将cct插入到表达载体pET-29a(+)中,构建了重组质粒pET-29a-cct,经过酶切验证和测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在30℃条件下经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示构建的工程菌可高效表达相对分子质量约45 k的蛋白,与理论值相符。对粗酶液进行活性测定,表达产物可检测到CCT酶活性,即可转化CTP和磷酸胆碱为CDP-胆碱,此结果可为CDP-胆碱的生物合成提供依据。