CEA启动子控制HSV-TK基因表达对人结直肠癌细胞的杀伤作用

构建了以CEA启动子控制的HSV-TK基因表达质粒pCEA-TK。转染pCEA-TK的人结肠癌细胞LoVo对GCV的敏感性提高了1300倍。同样条件下,人宫颈癌细胞HeLa对GCV的敏感性仅提高8倍,且对低于血药浓度(20μmol/L)的GCV不敏感。以上结果显示在GCV存在时,CEA启动子控制下HSV-TK基因的表达使CEA阳性的人结直肠癌细胞获得专一性杀伤。此外,DNA片段分析和电镜观察表明GCV诱导转染pCEA-TK的LoVo细胞发生凋亡可能是这个系统杀死肿瘤细胞的机制之一。本工作还讨论了癌胚抗原(CEA)基因启动子用于人结直肠癌专一性自杀基因治疗的可能性。

CEA启动子启动双自杀基因CD/TK重组AdEasy XL腺病毒构建

目的构建含有CEA启动子(CEApromoter,Cp)启动的双自杀基因CD与TK的复制缺陷型腺病毒。方法设计带有限制性内切酶酶切序列的PCR引物。在2μlT4DNAligase作用下,Cp插入pAdTrack(pAT)的MCS,形成pAT.Cp;CD插入pAT.Cp的MCS,形成pAT.Cp.C;TK插入pAT.Cp.C的MCS,形成pAT.Cp.C.T。5μgpAT.Cp.C.T经4μlPmeI线化后,转化BJ5183AD1,1μlPacI酶切鉴定。重组AdEasy质粒转化XL10Gold细胞,大量扩增提取纯化,转染5×105AD293细胞,荧光显微镜观察,制备带有Cp.C.T重组腺病毒(recombinantadenoviruswithCp.C.T,RACp.C.T),测定病毒滴度。结果pAT.Cp,pAT.Cp.C,pAT.Cp.C.T双酶切以及PCR均见长约500bp的Cp,1300bp的CD,1100bp的TK。对照质粒DNA转化BJ5183AD1效率为7.36×106cfu/μg。线化pAT.Cp.C.T转化BJ5183AD1,形成重组AdEasy质粒DNA,PacI酶切见典型长约3.0或4.5kb与30.0kbDNA片断。重组质粒转染AD293出现绿色荧光。RACp.C.T滴度为5.67×107pfu/ml。结论RACp.C.T构建正确;AdEasyXL腺病毒载体系统转导Cp.C.T具有高效性,易于观察转染效果。

CEA启动子驱动下表达Hsp70基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建癌胚抗原（CEA）启动子驱动下靶向表达热休克蛋白70（HspTO）基因的重组腺病毒。方法通过RT-PCR和PCR的方法分别扩增人Hsp70基因和CEA启动子，构建穿梭质粒pDC316-pCEA—Hsp70。将所得的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-pCEA—Hsp70。通过梯度离心纯化病毒，采用半数细胞培养物感染量测定病毒滴度。分别以重组的腺病毒感染CEA阳性的人胰腺癌BxPC3细胞和CEA阴性的SWl990细胞，通过RT-PCR和ELISA法检测Hsp70 mRNA和蛋白的表达。结果酶切和测序证实Hsp70基因和CEA启动子成功插入PDC316质粒。与骨架质粒共转染293细胞获得的病毒经PCR扩增证实重组腺病毒构建成功。最终获得的病毒颗粒数达2．2×10^11vp／ml，滴度为1．5X10^10PFU／ml。重组腺病毒感染CEA阳性表达的BxPC3细胞后，可显著增加Hsp70 mRNA和蛋白的表达，而感染CEA阴性的SWl990细胞，Hsp70mRNA和蛋白的表达无变化。结论成功构建了能够在CEA阳性细胞中靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒Ad5-pCEAHsp70，为进一步研究奠定了基础。

hTERT启动子介导自杀基因在肿瘤细胞中的靶向表达

肿瘤的基因治疗中，如何保证自杀基因只在特异性组织或细胞中表达而不在人正常组织细胞中表达是一个亟待解决的问题。与特异性组织来源的启动子如CEA启动子、AFP启动子、Tyr启动子等启动子相比，运用hTERT启动子能够驱动自杀基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中靶向表达，更具广谱性，因此在肿瘤治疗中成为一个有广阔前景的新方法。

新型结肠癌个性化治疗重组溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13的构建

一种新型的重组溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13被成功构建。该病毒利用CEA(carcinoembryonic antigen)启动子和ST13基因特异性增强ZD55系统的肿瘤靶向性。实验表明,重组溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13能在结肠癌细胞株SW620中增殖;Ad-CEA-ZD55-ST13增加ST13基因在HCT116细胞中的表达量;Ad-CEA-ZD55-ST13比对照病毒Ad-CEA-ZD55-EGFP对HCT116的杀伤作用强。

阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk对CEA阳性肺癌的杀伤作用

目的 增强E .colicd/HSV 1tk自杀基因的细胞毒性 ,实现阳离子脂质体介导pE CEA cd tk/5 FC +GCV体系靶向杀伤CEA阳性肺癌。方法 PCR法分别扩增出CMV增强子 ,CEA启动子 ,cd tk ,构建真核表达载体 pE CEA cd tk ;MTT法检测pE CEA cd tk/5 FC +GCV体系的体外细胞毒性。体内实验采用肺腺癌细胞SPC A 1裸鼠皮下移植瘤模型。通过肿瘤局部或鼠尾静脉注射脂质体 /pE CEA cd tk复合物 ,腹腔注射GCV +5 FC前体药物进行治疗。结果 阳离子脂质体介导pE CEA cd tk/5 FC +GCV体系体外可靶向杀伤CEA阳性肺癌细胞 ,这种杀伤作用存在显著的细胞差异 ;体内可抑制小鼠皮下肺肿瘤结节的生长 ,荷瘤鼠存活期延长。结论 阳离子脂质体介导 pE CEA cd tk/5 FC +GCV体系体内外对CEA阳性肺癌均具有较强的杀伤作用。

靶向重组腺病毒介导Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用

目的:观察重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌移植瘤生长的影响,并分析其相关机制.方法:建立大鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,随机分为3组,分别给予Ad5-pCEA-Hsp70、Ad5-control以及PBS进行治疗.对比不同时间点3组肿瘤大小,评价抑瘤效果:通过ELISA的方法检测外周血Hsp70蛋白含量及细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的含量;取动物的移植瘤常规HE染色,观察淋巴细胞浸润情况;分离动物脾脏单核细胞,通过流式细胞仪检测CD83+细胞比例,并观察脾淋巴细胞对体外培养的大鼠胰腺癌细胞的杀伤能力.结果:治疗后第4、6、8周,Ad5-pCEA-Hsp70组肿瘤体积分别与Ad5-control组及PBS组相比(724.4mm3±81.6mm3vs901.3mm3±103.9mm3、987.5mm3±126.0mm3;681.3mm3±64.9mm3vs1270.6mm3±131.6mm3、1398.5mm3±193.0mm3;648.0mm3±65.9mm3vs1487.0mm3±243.0mm3、1660.0mm3±167.0mm3),差异均具有统计学意义(均P<0.01).Ad5-pCEA-Hsp70组动物外周血Hsp70蛋白及细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的含量均显著高于Ad5-control组和PBS组(均P<0.01).HE染色发现,与Ad5-control组和PBS组相比,Ad5-pCEA-Hsp70组有较多的淋巴细胞浸润.经流式细胞仪检测,Ad5-pCEA-Hsp70组脾单核细胞中CD83+细胞比例显著高于Ad5-control组及PBS组(10.8±1.3%vs5.1±0.6%、4.8±0.6%;均P<0.01).脾淋巴细胞介导的CTL实验中,当效靶细胞比为1:1时,3组动物之间并无统计学差异(P>0.05),但随着效靶细胞比的增加,Ad5-pCEA-Hsp70组对胰腺癌细胞的杀伤能力较Ad5-control组和PBS组明显增加(P<0.05,P<0.01).结论:重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌动物模型的肿瘤生长具有抑制作用,其机制与促进树突状细胞(dendritic cells,DC)的成熟、诱导细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的分泌、促进淋巴细胞浸润有关.

CMV早期转录增强子对人癌胚抗原启动子效率的作用研究

为了探讨人巨细胞病毒(CMV)早期转录增强子用于癌胚抗原(CEA)阳性肿瘤的靶向基因治疗的意义,我们参考有关文献利用PCR法分别克隆了369 bp的人CEA启动子和531 bp的CMV早期转录增强子,构建了相应的pGL4.10荧光素酶报告基因载体,与内参照pGL4.74质粒共转染CEA阳性的人肠癌细胞LoVo、HT-29、SW620、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF7和CEA阴性的肠癌细胞SW480、宫颈癌细胞HeLa、人肺成纤维细胞LL47,利用双荧光素酶检测系统检测分析了这些细胞中CEA重组启动子的效率。结果表明,CMV增强子能够明显增强CEA启动子在CEA阳性细胞中的效率(提高7.46至70.16倍),但是也能提高CEA启动子在CEA阴性细胞中的效率(提高24.01至76.40倍)。因此上述CMV增强子虽然可以大大提高CEA启动子的效率,但是对特异性有影响,在将其用于CEA阳性肿瘤基因治疗时还需采用其它保证特异性的手段。