miR-155与CEBPB的靶向验证及繁殖性能相关基因的检测

CEBPB具有调节黄体生成促进排卵的作用,对动物繁殖性能极为重要,试验旨在通过构建CEBPB的3′端非翻译区(3′UTR)双荧光素酶报告基因载体,验证MicroRNA-155(miR-155)调控CEBPB的分子机制。应用在线生物信息学软件预测miR-155与CEBPB基因3′UTR的靶向结合区,PCR扩增获取民猪组织基因组的CEBPB的3′UTR,将其插入psi-Check-2载体,构建野生型(wt-3′UTR)和突变型重组表达载体(mut-3′UTR),鉴定正确后,分别与miR-155模拟物(mimics)/抑制物(inhibitor)/阴性对照物(NC)共转染到PK15细胞,检测荧光素酶活性及CEBPB表达情况。结果表明:成功构建了CEBPB的3′UTR野生型和突变型表达载体,双荧光素酶报告基因检测显示wt-3′UTR/miR-155 mimics组的萤火虫荧光素酶活性受到显著抑制(p<0.05);而mut-3′UTR/miR-155 inhibitor组的萤火虫荧光素酶相对活性与对照组相比变化不显著(p>0.05)。实时荧光定量结果显示,miR-155 mimics组CEBPB、BMP1和PPARG表达水平显著低于miR-155 NC组(p<0.05),而miR-155 inhibitor组CEBPB表达水平高于miR-155 NC组(p<0.05)。综上表明,miR-155可以靶向负调控CEBPB的表达。