CELI粗提物用于点突变检测的技术

本文以含有单个错配的DNA异质双链为底物鉴定芹菜CEL I粗提物的错配切割酶学活性,并对影响其切割错配的反应条件进行优化,建立以CEL I粗提物为基础的点突变酶学检测技术。结果表明:自制的CEL I粗提物能有效识别和切割DNA异质双链中碱基错配。当异质双链DNA量恒定时,在一定的范围内CEL I粗提物用量对错配切割效果的影响不明显,由PCR产物形成的12μl异质双链DNA可用蛋白质总量约900ng的CEL I粗提物进行有效切割。常规PCR缓冲液与已报道的CEL I缓冲液的效果基本相近,实际工作中可选用PCR缓冲液作CEL I酶切反应液;缓冲液pH值对错配切割效果具有明显的影响,适宜pH约近中性(6.5～7.5)。Zn2+对错配切割具有促进作用,但不是必需的,最适浓度为0.25mmol/L。CEL I粗提物切割错配的反应时间以42℃下酶切20min为宜。比较试验显示,本研究建立技术的点突变检测效果与Transgenomic公司试剂盒SurveyorTM基本相同。

几种因素对芹菜CEL Ⅰ核酸酶提取的影响

为有效提取芹菜CEL Ⅰ核酸酶和进一步利用它建立点突变检测技术,分析了品种、器官、发育时期和提取液pH值对其提取量的影响,并以含有单个错配的DNA异质双链为底物鉴定其对错配切割的酶学活性.结果表明:不同芹菜品种和器官间CEL Ⅰ提取量的差异分别达到显著和极显著水平,在比较的3个不同品种(雪白、文图拉和泰国黄心芹)中,以品种泰国黄心芹的CEL Ⅰ提取量最高;而在测定的3种不同器官中,叶片的CEL Ⅰ提取量远远高于茎秆和根;以上海黄心芹为材料比较发育时期对提取量的影响表明,生殖生长期的CEL Ⅰ提取量明显高于营养生长期;缓冲液pH值对CEL Ⅰ提取量也有重要影响,pH 7.5缓冲液的CEL Ⅰ核酸酶提取量高于pH 5.5和pH 9.5;酶学活性鉴定显示,CEL Ⅰ核酸酶粗提物能有效地识别和切割DNA异质双链中的碱基错配.

自升式钻井平台插拔桩对邻近平台变形和桩靴承载力的影响研究

自升式钻井平台桩靴插拔过程会扰动周边土体,使邻近平台桩靴基础的承载性能受到不利影响。基于弹性理论,求解桩靴脚印周边土体卸荷程度与影响范围,结合模型试验,揭示距插拔位置不同距离/直径(L/D)条件下土体强度的衰减规律;利用CEL大变形和桩靴脚印拟静力计算方法,分析某油田的自升式钻井平台桩靴插拔过程,揭示桩靴插拔对周边土体应力、邻近平台变形和桩靴承载力的影响规律。

水蛭提取液体外对人视网膜色素上皮细胞PAR-1表达的影响

目的:研究水蛭提取液对人视网膜色素上皮(retinal pigment epichelial,RPE)细胞PAR-1表达的影响。方法:水蛭提取液体外单独或与凝血酶共同作用于人RPE细胞后,用免疫荧光法测定PAR-1的荧光表达。结果:PAR-1的免疫荧光光密度值比较:(1)凝血酶组与正常对照组比较,PAR-1的IOD值下降(1608±675,4036±1134,P<0.01)。(2)单加水蛭提取液组与正常对照组比较,PAR-1的IOD值升高(9998±2374,4036±1134,P<0.01)。(3)凝血酶和水蛭提取液同时加药组与凝血酶组比较,PAR-1的IOD值显著升高(19664±5436,1608±675,P<0.01)。表明水蛭提取液能竞争性抑制凝血酶对PAR-1的活化作用。结论:水蛭提取液能抑制凝血酶诱导的人RPE细胞膜上的PAR-1的活化,阻断PAR-1介导的细胞信号传导。

三种方法提取血清miRNA效果的比较

目的比较Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA的效果。方法分别选取2例健康人、2例肺炎患者和2例肺癌患者血清,以Let-7a-5p作为目标mRNA,线虫Cel-miR-39-3p作为内参,分别采用Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA,以Let-7a-5p及Cel-miR-39-3p特异性引物进行反转录PCR,以反转录PCR产物为模板运用SYBGreenⅠ法进行荧光定量PCR检测。结果 Trizol法与蛋白酶K消化+Trizol法均能有效提取到血清miRNA,而沉淀裂解法由于没有对血浆中的RNA进行富集故提取效果不佳。Trizol法提取较蛋白酶K消化+Trizol法相比,可以减少蛋白酶K的消化时间且提取效果更好,并且血清与Trizol试剂的体积比为200∶600时效果相对较好。三种方法检测Cel-miR-39-3p的Ct值基本一致。Trizol法和蛋白酶K消化+Trizol法在提取过程中加入的内参丢失较少。结论 Trizol法作为总RNA提取的手段适用于血清miRNA提取,通过调整血清与Trizol试剂的用量可使提取到的血清miRNA能够满足试验需要。

山竹提取物对胃癌SGC-7901细胞的体外实验研究

目的观察山竹提取物(GME)对人胃癌细胞SGC-7901增殖情况的影响,探讨其作用机制。方法采用新型四氮唑盐法(MTS)检测GME对SGC-7901细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测GME对SGC-7901细胞凋亡和诱导活性氧(ROS)水平的影响;采用Western blot检测不同浓度GME对BGC-7901细胞的PTEN、Bax、Bcl-2表达的影响。结果 GME显著抑制SGC-7901细胞的增殖(P<0.05),与阳性对照组5-氟尿嘧啶(5-FU)相比抑制率也较高(P<0.05),其半数抑制浓度为:7.89μg/ml。经5、7.5μg/ml的GME处理24h后,可有效促进SGC-7901细胞凋亡(P<0.05),ROS水平的累积;GME相同方式处理后,SGC-7901细胞中PTEN和Bax的蛋白表达量上调,Bcl-2蛋白表达量降低(P<0.05)。结论 GME能够显著抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖,能够诱导SGC-7901细胞ROS水平的累积,并通过影响PTEN、Bax和Bcl-2蛋白的表达,促进其凋亡。

桩靴贯入与拔出引起的邻近桩附加及残余荷载分析

自升式钻井船桩靴贯入与拔出土层后会导致周围土体发生不可恢复的大变形,从而使邻近平台桩基础受到附加荷载作用。目前,对于钻井船插拔桩引起的附加荷载少有分析,且没有较成熟的计算方法。为此,建议了一种分析钻井船插拔桩附加荷载的方法。该方法首先通过耦合欧拉-拉格朗日(CEL)大变形有限元算法计算出桩靴贯入与拔出土层时邻近桩的水平位移;然后依据计算出的桩身水平位移,利用正交函数最小二乘法确定桩身位移分布函数,进而依据主动桩的p-y关系曲线及梁的弯曲理论确定出桩身受到的附加荷载;最后利用非线性地基梁模型,分析附加荷载作用下的桩身内力响应。通过对软粘土中钻井船插拔桩离心模型试验的数值仿真模拟,验证了这种分析附加及残余荷载方法的可行性。

油莎草提取物对慢性应激诱导小鼠抑郁样行为的改善和作用机制初探

目的:研究油莎草提取物对慢性温和不可预见性应激(CUMS)小鼠的抗抑郁功效及机制。方法:采用CUMS程序持续6 w建立抑郁模型,造模成功后,随机将小鼠分为模型组、阳性组、油莎草须根水提物剂量组、油莎草须根醇提物剂量组、油莎草地上茎叶水提物剂量组、油莎草地上茎叶醇提物剂量组、油莎豆水提物剂量组、油莎豆醇提物剂量组,每组14只。灌胃给药,持续30 d,模型组和正常组灌胃等体积的双蒸水,阳性组氟西汀按20 mg/(kg·d)BW灌胃,其余6组皆按200 mg/(kg·d)BW灌胃。除正常对照组外,其余组均采用CUMS小鼠模型,并观察油莎草提取物对小鼠行为学、生化指标和皮质酮等指标的影响。每周进行体重称量,采用旷场实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验等行为学方法评价小鼠的抑郁状态;采用试剂盒法测定小鼠血清MDA含量、SOD、GSH-PX活性等生化指标,采用酶联免疫分析(ELISA)法测定小鼠血清皮质酮含量。结果:与正常组比较,模型组小鼠生长缓慢,运动功能明显受到抑制,小鼠水平、垂直运动得分降低(P<0.01),游泳不动时间明显延长,糖水相对消耗量明显降低(P<0.01);血清SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量明显增高(P<0.01),皮质酮水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,油莎草提取物各组小鼠生长正常,小鼠水平、垂直运动得分提高(P<0.01),游泳不动时间显著缩短(P<0.01),蔗糖水相对消耗量明显升高(P<0.01);血清SOD、GSH-Px活力提高,MDA含量明显降低(P<0.01),小鼠血清皮质酮水平明显降低(P<0.01);与正常组比较无统计学差异。结论:油莎草提取物对慢性应激所引起的抑郁症状有一定的改善功效,其作用机制可能与抑制HPA轴功能紊乱,改善机体自由基损伤状态,增强SOD、GSH-Px活力,降低MDA含量等多种途径有关。