CEP33779通过影响JAK2与转化生长因子β_(1)的串话机制来减轻类风湿关节炎大鼠相关肺纤维化的实验研究

目的在牛Ⅱ型胶原免疫诱导类风湿节炎大鼠的基础上,气管注入博来霉素,构建RA合并肺纤维化大鼠模型来观察JAK2抑制剂CEP33779对RA大鼠肺纤维化的改善程度及可能机制。方法①体内研究:将SD大鼠随机分为正常组、单纯肺纤维化组、肺纤维化CEP治疗组、RA合并肺纤维化组、RA合并肺纤维化CEP治疗组。造模当天(d0)大鼠尾部皮下注射牛Ⅱ型胶原0.2 ml(1 mg/ml)构建RA模型;造模第13天(d13)气管内注射100μl博来霉素(2.5 mg/kg)诱导肺纤维化模型;造模第14天(d14)治疗组予以CEP(10 ml/kg每日1次)灌胃,共4周。测定大鼠右后足关节肿胀度并行关节炎指数评分,检测肺顺应性(Cst)和肺比重,HE和Masson染色观察左肺病理变化,蛋白免疫印迹法(WB)检测右肺胞外基质水平。②体外研究:TGF-β_(1)(10 ng/ml)刺激人胚肺成纤维细胞(HFL1)24 h和48 h后,用免疫荧光法检测p-JAK2表达;HFL1接种培养板后,设置空白组、TGF-β_(1)刺激组、TGF-β_(1)+LY2109761(TGFβ-R1/2抑制剂,0.5 mmol/L和2 mmol/L)组、TGF-β_(1)+CEP(0.1 mmol/L和1.0 mmol/L)组共育48 h,WB测定TGFβ-R_(2)、α-SMA、JAK2、Col1表达水平。多组间比较采用Tukey′s检验,两组间比较采用独立t检验。结果①体内研究:与正常组(1.45±0.04)相比,RA+PF+Vehicle组第13天大鼠关节肿胀度升高[(2.54±0.16),t=16.02,P<0.001],CEP治疗3 d后第16天开始大鼠平均关节炎指数评分、足趾体积降低[(2.89±0.11),t=5.78,P<0.001;(1.92±0.13),t=6.85,P<0.001]。肺纤维化大鼠肺组织有不同程度的肿大,肺比重升高、Cst下降,肺炎症和纤维化程度升高[(0.96±0.06),t=19.76,P<0.001;(0.26±0.09),t=17.64,P<0.001;(3.63±1.51),t=6.00,P<0.001;(1.75±0.71),t=5.84,P<0.001]。CEP灌胃后,RA合并肺纤维化大鼠肺肿胀减轻,肺比重下降、Cst增加[(0.82±0.05),t=5.76,P<0.001;(0.43±0.18),t=2.31,P=0.038],肺组织纤维化和炎症程度评分[(3.00±1.00),(1.56±0.52)]均有下降趋势,但差异无统计学意义。CEP可抑制肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β_(1)、TGFβ-R_(2)、α-SMA、Fn和JAK2的表达,5组间差异均有统计学意义(F=9.02,P=0.017;F=4.86,P=0.048;F=6.57,P=0.032;F=11.26,P=0.010;F=13.32,P=0.007)。②体外研究:TGF-β_(1)可刺激HFL1表达更强的磷酸化的JAK2(p-JAK2)荧光信号;WB可见TGFβ-R_(2)、α-SMA、JAK2和Col1表达显著增加,LY、CEP干预后,上述蛋白呈浓度依赖性减少,5组间差异均有统计学意义(F=337.30,P<0.001;F=20.61,P<0.001;F=100.60,P<0.001;F=180.90,P<0.001)。结论JAK2抑制剂对RA相关肺纤维有改善作用,其机制可能是通过干扰JAK2与TGF-β_(1)信号通路的"串话"来减轻TGF-β_(1)所致的肺纤维化。