CEP55基因沉默对非小细胞肺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制

目的 探讨CEP55基因沉默对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞恶性生物学行为的影响及机制。方法 常规培养正常肺上皮细胞(BEAS-2B细胞)及NSCLC细胞(A549、H1299、H1975细胞),用Western blotting法检测细胞内CEP55蛋白,筛选CEP55蛋白表达最高的A549细胞为后续实验细胞。将A549细胞随机分为control组(只转染Lipofectamine2000)、si-NC组(转染Lipofectamine2000和NC序列)、si-CEP55组(转染Lipofectamine2000、si-CEP55序列)。用MTT法检测细胞增殖能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,用Western blotting法检测细胞内CEP55蛋白、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)相对表达量。结果 与si-NC组、control组比较,si-CEP55组CEP55蛋白相对表达量低(P均<0. 05)。与si-NC组、control组比较,si-CEP55组培养24、48、72 h细胞增殖能力(OD值)低,侵袭细胞数、迁移细胞数少,p-Akt、p-mTOR蛋白表达低(P均<0. 05)。结论 沉默CEP55基因可抑制NSCLC细胞增殖、侵袭及迁移,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活有关。

CEP55慢病毒表达载体构建和U251-CEP55细胞株的建立

目的:构建CEP55慢病毒表达载体,建立稳定表达CEP55的人脑胶质瘤U251细胞株。方法:使用PCR扩增方法将CEP55基因序列进行扩增,转入质粒中,并整合到载体上,构建重组质粒GV358-CEP55载体。与p Helper 1.0和p Helper 2.0质粒共转染293T细胞使其产生慢病毒,以GV358空载体包装的慢病毒作为对照。显微镜观察绿色荧光蛋白GFP表达强度,确定慢病毒的感染效率。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染人胶质瘤细胞株U251后,经嘌呤霉素筛选出稳定表达CEP55基因的细胞株U251-CEP55。q RT-PCR和Western blot两种方法分别检测CEP55 m RNA及蛋白的表达。结果:测序证实慢病毒表达载体GV358-CEP55构建成功;转染293T细胞获得高滴度的病毒。病毒感染U251细胞后,使用嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株U251-CEP55;q RT-PCR和Western blot方法分别检测后发现,U251-CEP55细胞株中CEP55 m RNA和蛋白水平的表达明显高于对照组。结论:成功构建CEP55慢病毒表达载体,获得稳定表达CEP55的人胶质瘤U251细胞株,为CEP55基因功能的探究给予了一定的实验基础。