猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达及对肌球蛋白重链基因表达的影响

猪CFL2b基因主要在骨骼肌中表达,对肌肉的发育和肌纤维的形成具有一定作用。为了解猪CFL2b基因与肌纤维性状的相关性,利用定向克隆和基因转染技术获得能稳定表达猪CFL2b基因的成肌细胞株,荧光显微镜观察及Western Blotting检测CFL2b基因在成肌细胞中的表达;应用实时定量PCR技术对细胞内肌球蛋白重链基因(MyHC)的表达变化进行检测。结果显示:CFL2b基因对MyHC的表达有明显影响,其中MyHC2x基因和MyHC2b基因的表达明显上调,MyHC1/slow的表达变化不明显。表明CFL2b基因与猪的肌纤维性状密切相关,推测猪CFL2b基因的高表达可能导致猪的不良肉质性状,可以考虑将CFL2b基因作为猪肉质性状的候选基因。

猪CFL2b基因部分序列的克隆及组织表达谱分析

在猪QTL定位基础上,利用比较基因组学原理,参照猪CFL2的cDNA序列,对猪CFL2基因的部分基因组DNA序列进行克隆、测序;利用RT-PCR半定量法检测CFL2基因在不同组织的表达情况.结果显示,所克隆的猪CFL2基因部分基因组DNA序列长度为2377bp,包括4个外显子和4个内含子,该基因mRNA序列与已报道的人CFL2b基因序列相似性为89%;猪CFL2基因在多种组织中均有表达,但在骨骼肌和心肌中表达丰度较高.结果表明,本研究成功测序了猪CFL2b基因部分基因组DNA序列,为进一步研究该基因与肌肉发育及生理功能的关系奠定了基础.

猪CFL2b基因cDNA克隆初步分析

利用基因表达谱芯片分析法筛选出与大白猪高肌肉产量-肌纤维形成有关的CFL2b基因.参考人和小鼠CFL2b基因序列,采用SMART-RACE技术结合EST序列拼接技术,从猪骨骼肌肌肉中首次克隆了猪CFL2b的全长cDNA序列(GenBank登录号EU561660,EU561661),Northern杂交检测CFL2b基因mRNA.结果表明,猪CFL2b基因含有2个转录本,长转录本3012bp,短转录本1466bp.CFL2b基因在多种真核生物中都有表达,且编码区序列非常保守,开放式读码框501bp编码了166个氨基酸的蛋白质.氨基酸序列分析表明,猪CFL2b基因与人和小鼠氨基酸同源性分别为100%和99.1%.核苷酸序列相似性分别为88.1%和74.9%.

CFL2基因研究进展

CFL2(Cofilin2)基因是肌动蛋白结合蛋白cofilin家族的新成员,主要在哺乳动物的骨骼肌和心肌表达,被认为是肌肉组织肌动蛋白装配的调节器,对正常肌肉功能和肌肉再生起着重要的作用。目前未见对CFL2基因进行全面介绍的文章,因此拟对CFL2基因的表达、结构、蛋白功能及其与肌病相关性方面的研究进展作一综述。

猪新基因CFL2真核表达载体的构建及在C2C12细胞中的瞬时表达

从猪的股二头肌中提取总RNA,利用RT-PCR技术从猪骨骼肌中获得CFL2基因的编码区序列,T-A克隆至PMD-18T载体,经HindⅢ和XhoⅠ酶切后定向克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)中。获得的重组质粒pCDNA3.1(+)/CFL2用限制性内切酶酶切分析和DNA测序分析鉴定,并经脂质体瞬时转染C2C12细胞,最后利用PCR检测转基因细胞中CFL2基因的存在及其表达情况。结果显示:猪CFL2基因已克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,转染的C2C12细胞中检测到细胞内较高量CFL2的表达。pCDNA3.1(+)/CFL2真核表达载体的成功构建,为深入研究CFL2基因在猪肌肉细胞中的功能奠定基础,为猪肉质品质的改良提供了新的思路。

CFL2基因研究进展

CFL2基因是肌动蛋白结合蛋白家族的重要成员,研究发现,CFL2基因主要在哺乳动物的骨骼肌和心肌中表达,在肌肉组织肌原纤维发生和解聚过程中调节肌动蛋白的转换,对维持肌肉正常的生长发育和功能起着非常重要的作用。文章总结了CFL2基因结构、表达特性及其在细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭以及家畜经济性状(生长性状和肉质性状)中的重要作用,以期为进一步提高家畜养殖的经济效益以及育种改良寻求有效途径。

猪CFL2b/荧光蛋白融合基因在小鼠成肌细胞中的表达与定位

[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。

CFL2基因半定量多重RT-PCR检测方法的建立

目的在CFL2基因功能的研究中,建立一种能检测CFL2基因mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系。方法细胞总RNA经反转录合成cDNA,以GAPDH为内参与CFL2进行同管扩增,以常规PCR体系为参照对退火温度、Mg^(2+)、dNTP和循环数等参数进行优化并与常规组比较,建立了检测C2C12细胞CFL2基因半定量多重RT—PCR体系。结果CFL2和GAPDH的cDNA同时PCR扩增后电泳条带清晰,与预期产物大小一致,两对引物间无明显竞争,其扩增效率和特异性与单一基因的RT—PCR体系相同。结论成功建立CFL2基因半定量多重RT—PCR方法,有利于半定量检测CFL2 mRNA表达变化。

猪CFL2基因启动子的克隆及转录活性分析

Cofilins(CFL)包括CFL1和CFL2,是真核细胞中肌动蛋白结合蛋白家族的成员。哺乳动物CFL2基因主要在骨骼肌和心脏中表达,对肌纤维形成和肌肉再生具有重要作用。为了研究猪CFL2基因的转录,试验运用Genome walking对CFL2基因的主要转录起始位点上游2.5kb序列进行克隆;运用PCR扩增猪CFL2基因5′侧翼区的12个DNA片段,并插入荧光素酶报告载体pGL4.10构建重组载体;所有重组报告基因载体转染C2C12、NIH3T3或HeLa细胞,48h后分别测定其荧光素酶活性。生物信息学分析结果表明,该序列中存在2个TATA盒(-508和-453bp)、1个GC盒和1个CAAT盒;预测CFL2基因启动子区存在的转录因子结合位点有SP1、AP1、AP2和GATA-1。pGL4.10-1554(-1502^+51bp)的转录活性最高,启动子活性区域为-1502^-1317bp。本研究结果为进一步研究CFL2基因转录调控奠定基础。

CFL2基因新发位点变异致杆状体肌病1例

杆状体肌病是先天性肌病的一种,因肌肉病理检查发现杆状体结构而得名,由于基因变异导致骨骼肌细肌丝及相关组分受累引起,病变主要累及骨骼肌,心肌很少受累,临床表现以肌无力、肌张力减低为主。目前尚无特异性治疗方法,治疗目标主要是改善症状,提高生存质量。本文报道1例CFL2基因新发位点变异导致的新生儿杆状体肌病。

miR-199调控CFL2蛋白表达对慢性粒细胞白血病细胞增殖和侵袭影响

目的肿瘤细胞内的CFL2参与细胞凋亡转移过程,本研究探讨miR-199调控CFL2蛋白的表达对慢性粒细胞白血病细胞增殖和侵袭的影响。方法qPCR检测不同慢性粒细胞白血病细胞株miR-199和CFL2表达水平;分析miR-199表达和慢性粒细胞白血病临床患者复发率和生存期的相关关系;双荧光素酶实验检测miR-199和CFL2之间的相互关系;平板克隆实验检测miR-199对KG-1细胞增殖和凋亡的影响,Transwell侵袭实验检测miR-199对KG-1细胞侵袭能力的影响。平板克隆实验和Transwell侵袭实验检测过表达CFL2后对KG-1细胞增殖和侵袭能力的逆转作用。结果与其他慢性粒细胞白血病细胞株相比,KG-1细胞中miR-199表达为(1.02±0.11)%,明显较高,且CFL2表达为(0.36±0.05)%,明显较低;双荧光素酶实验显示,miR-199可以调控CFL2蛋白的表达水平;平板克隆实验和凋亡实验显示,miR-199可以促进KG-1细胞的增殖,抑制其凋亡行为;Transwell侵袭实验结果显示,miR-199-mimic组细胞侵袭量为426.5±29.6,较对照组(193.6±18.6)明显升高,差异有统计学意义,P=0.016;而过表达CFL2可以逆转其作用。结论 miR-199可以靶向CFL2蛋白影响慢性粒细胞白血病细胞的增殖和侵袭行为。

鸡CFL2基因3′UTR多态性与肉质性状的关联分析

以固始鸡×安卡鸡F2代资源群为研究对象,利用PCR-RFLP方法检测鸡CFL2基因3′UTR多态性,并将不同基因型与肉质性状进行相关性分析。结果表明:在鸡CFL2基因3′UTR区预测到5个microRNA靶位点。在CFL2基因3′UTR区发现G577A位点,该位点为KpnⅠ自然酶切位点,表现为GG、AA和GA 3种基因型,基因型频率分别为0.589、0.349和0.061,经χ2适合性检验,该位点在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。该突变位点对鸡的腿肌肌纤维密度和肌纤维直径具有显著影响(P<0.05)。结果显示,CFL2基因对鸡的腿肌肌纤维性状有一定影响,同时为该基因的标记辅助育种和进一步研究提供参考。

猪CFL2基因启动子的克隆与序列分析

CFL是真核生物肌动蛋白结合蛋白家族的成员。CFL2主要在哺乳动物的骨骼肌和心肌表达,在肌肉纤维的形成过程及肌肉的再生起重要作用。为了深入研究猪CFL2基因转录的调控机制,本研究利用染色体步移法首次获得了CFL2基因起始密码子上游约2.5 kb区域的序列。应用相关生物信息学软件对该序列进行分析,预测了其启动子核心区域及转录起始点,发现在起始密码子上游-508 bp和-453 bp两处存在TATA-box,另外还发现了GC-box、CAAT-box;该序列还包含SP1、AP1、AP2、GATA-1等转录因子结合位点。本试验结果为进一步研究该基因表达调控与肌肉发育的关系奠定了基础。

猪CFL2基因荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

为了进一步深入研究猪CFL2基因转录调控机制,通过PCR方法,从猪基因组DNA中获得CFL2基因起始密码子上游12段逐步缺失的CFL2启动子序列,分别定向克隆至含有荧光素酶报告基因的pGL4.10载体上。构建了12种荧光素酶报告基因载体:pGL4.10-222、pGL4.10-383、pGL4.10-482、pGL4.10-666、pGL4.10-912、pGL4.10-1021、pGL4.10-1093、pGL4.10-1305、pGL4.10-1369、pGL4.10-1554、pGL4.10-1680、pGL4.10-1826。以pGL4.74为内参质粒,分别瞬时转染小鼠成肌细胞C2C12、小鼠成纤维细胞NIH3T3、人宫颈癌细胞HeLa,48 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果表明:pGL4.10-1554(-1 502^+51 bp)的转录活性最强,初步证实-1 502^-1 317 bp区域为CFL2启动子的活性区域,从而为进一步研究CFL2的转录调控奠定了基础。

猪CFL2基因启动子区CpG岛的甲基化研究

运用生物信息学方法对猪CFL2基因启动子区CpG岛进行预测,并采用甲基化特异性PCR （MSP）和重亚硫酸盐测序（BSP）分析猪CFL2基因启动子区CpG岛的甲基化状态.生物信息学研究发现,猪CFL2基因启动子区存在CpG岛,并且在启动子区的995 ～2 045 bp区域的GC分布密集.通过BSP法证明了长白猪CFL2基因启动子区CpG岛出现甲基化,MSP法出现部分甲基化,提示只有1条链被甲基化,为猪CFL2基因在肌肉组织中的表达可能受甲基化调节提供了理论基础。

利用免疫共沉淀验证肌纤维形成相关蛋白CFL2与MEF2C的相互作用

利用免疫共沉淀技术验证丝切蛋白(CFL2)和肌细胞增强因子-2(MEF2C)之间的相互作用关系。构建带绿色荧光蛋白(GFP)的p EGFP-N1-CFL2和p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP-his-MEF2C重组载体,经双酶切鉴定正确后,分别将上述重组载体共转染至人宫颈癌细胞(Hela),利用免疫共沉淀方法验证CFL2和MEF2C之间的相互作用关系。结果表明,p EGFP-N1-CFL2和p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFPhis-MEF2C重组载体共转染Hela细胞,分别用抗CFL2和抗MEF2C抗体沉淀蛋白复合物,用MEF2C和CFL2抗体进行Western blot检测,检测到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP-his-MEF2C和p EGFP-N1-CFL2的表达。本试验成功构建p EGFP-N1-CFL2和p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP-his-MEF2C真核表达重组载体,在Hela细胞中表达后利用免疫共沉淀的方法证实了CFL2和MEF2C之间存在相互作用。

CFL2基因低表达对骨骼肌肌纤维相关基因的表达影响

为了研究CFL2基因与骨骼肌纤维相关基因之间的关系,本试验运用已筛选的CFL2低表达细胞株,利用实时定量和Western blot技术检测CFL2基因低表达对肌纤维组成成分MLC、α-actin与肌纤维类型MyHCslow、MyHC2b、MyHC2a、MyHC2x表达的影响。结果表明,低表达CFL2后,肌纤维组成成分MLC和α-actin的表达均显著上调(P<0.05)。MyHC2x、MyHC2b、MyHC2a、MyHCslow的表达均显著下调(P<0.05)。说明CFL2可能起到通过调节MyHC类型转换来达到调节红白肌肉比例的效果,进而直接影响猪肉品质。

鼠肌纤维丝切蛋白CFL2互作蛋白的筛选与鉴定

筛选并鉴定小鼠腿肌组织中与丝切蛋白CFL2相互作用的蛋白质。通过免疫共沉淀技术分离小鼠腿肌组织中CFL2蛋白复合物,对获得的免疫共沉淀复合物进行SDS-PAGE分离,将分离出的差异条带用胰蛋白酶进行酶切,酶切后的肽段进行液相色谱分离,最后通过电喷雾质谱技术分析肽段组成并鉴定蛋白质,获得与CFL2互作的组织蛋白谱。通过Western blot检测,确定在天然状态下小鼠腿肌组织中CFL2与Ndufb7之间存在相互作用。首次利用免疫共沉淀联合质谱技术成功从小鼠腿肌组织中筛选并鉴定出与CFL2相互作用的蛋白Ndufb7,为进一步研究CFL2在骨骼肌肌纤维形成中的作用提供理论基础。

丝切蛋白CFL2基因低表达对小鼠成肌细胞C2C12肌纤维信号通路关键成分的影响

探讨低表达丝切蛋白CFL2基因对小鼠成肌细胞C2C12信号通路关键成分的影响。采用RNAi技术,将猪CFL2基因真核表达shRNA重组体稳定转染至小鼠成肌细胞C2C12后提取其总RNA和总蛋白质,采用Real-time PCR和Western blot检测CFL2基因低表达后成肌细胞C2C12信号通路关键成分(MEF2C、sk MLCK、Rho A、AMPKα2、p38和Ca M)的表达情况。结果表明:在3个稳转细胞株中MEF2C、Ca M、p38和AMPKα2的mRNA表达均为极显著下调(P<0.01),sk MLCK的mRNA表达为极显著上调(P<0.01),其它成分不显著;MEF2C和Ca M的蛋白表达在3个稳转细胞株中均为显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01),其他4种成分(p38、Rho A、AMPKα2和sk MLCK)均差异不显著(P>0.05),说明CFL2低表达显著下调信号通路关键成分MEF2C和Ca M的表达,CFL2与Ca M和sk MLCK分别呈显著正相关和负相关。