结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达

目的:探究结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达。方法:收集经病理学诊断的19例石蜡包埋肺结核组织标本,以20例正常肺组织(肺癌切除标本正常组织断端)为阴性对照,采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10,并与抗酸染色进行对比。结果:ESAT-6及CFP-10的阳性信号主要分布在结核病灶的坏死区域及其周围的巨噬细胞和多核巨细胞中,其分布与抗酸杆菌有关,范围更广。免疫组化检测ESAT-6的敏感度、特异度分别为73.68%、90.00%;CFP-10的敏感度和特异度分别为63.16%和95.00%;抗酸染色敏感度为52.63%,免疫组化的敏感度高于抗酸染色(P<0.05)。结论:采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10在结核诊断中有潜在的应用价值。

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值

目的:评价结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取初治肺结核病患者70例和健康体检者34例作为结核组和健康对照组,分离PBMCs,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原进行ELISPOT实验,检测斑点形成细胞数。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为85.7%(60/70)、77.1%(54/70)、72.9%(51/70),特异性依次为82.4%(28/34)、85.3%(29/34)、88.2%(30/34)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315作为抗原建立的ELISPOT检测方法在活动性肺结核的辅助诊断中有较高的应用价值。

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。

牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。

结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的通过构建结核分枝杆菌(结核菌)CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His-Tag)镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果构建了含CFP-10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原,ELISA方法检测214份血清,阳性率达77.1%。结论目的基因克隆入宿主菌中并成功表达,重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究

目的建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10的高亲和性适体。方法体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX技术筛选获得CFP-10的适体库。将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linkedoligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力。结果构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体。

结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用

目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10基因,构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109。结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上生长,β-半乳糖苷酶活性实验阳性。结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用。

重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法,快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌,为净化牛结核病提供技术支撑。【方法】以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原,建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA,并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件。【结果】重组CFP-10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为:以8μg/mL重组CFP-10蛋白包为被抗原,37℃下包被1 h,再以5%脱脂奶封闭1 h,血清(一抗)经1∶200倍稀释后作用1 h,然后以1∶500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(二抗)作用1 h。该间接ELISA的阴阳临界值为0.281,仅与牛分枝杆菌呈阳性反应,与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应;其敏感性能检测1∶320倍稀释的血清,批内与批间的变异系数均小于5.0%。【结论】建立的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点,临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测。

CFP-10/ESAT-6特异性IFN-g释放反应诊断活动性肺结核的研究

前期研究已经建立了基于结核分枝杆菌特异性抗原CFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激外周血单核细胞IFN-γ释放反应,本研究旨在证实该方法在活动性肺结核及结核菌潜伏感染诊断中的意义。实验对象包括111例当地医院收治的活动性肺结核病人(病例组)及283例某大学入学新生(健康对照者)。采集肝素抗凝血,分别加入含结核菌抗原CFP-10/ESAT-6、植物血凝素及无刺激物(PBS)的细胞培养孔中,培养过夜,次日收集血清,进行IFN-γ检测。同时,对其中58位病人志愿者及46位健康对照志愿者进行了结核菌素(PPD)皮内变态反应。病例组与健康对照组的PPD皮内变态反应阳性率分别为79.3%(46/58)和76.1%(35/46),无显著差异(P>0.05),表明PPD皮内变态反应不能用于活动性肺结核的检测。病例组IFN-γ体外释放反应的阳性率为95.5%(106/111),而健康对照组阳性率为16.3%(46/283),两组间均存在极显著差异,表明IFN-γ体外释放反应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度(95.5%)与良好的特异性。在健康组中,IFN-γ体外释放反应与PPD皮内变态反应的总符合率为50.0%,且IFN-g体外释放反应阳性者中,83.3%为PPD皮内变态反应阳性;在病例组中,二者的总符合率为72. 4%,IFN-g体外释放反应阳性者中,77.8%为PPD皮内变态反应阳性。CFP-10/ESAT-6特异性IFN-γ体外释放反应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度与特异性,PPD皮内变态反应由于受卡介苗免疫等因素影响在我国不能用于诊断活动性肺结核病与结核菌感染。

融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c ELISPOT辅助诊断活动性肺结核的应用价值

目的:评估结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取肺结核病患者78例,非结核性肺部疾病患者27例和健康体检者39例,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原刺激单个核淋巴细胞(PBMCs),采用酶联免疫斑点试验检测斑点形成细胞数,判断肺结核感染情况。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的敏感性依次为87.2%(68/78)、80.8%(63/78)、76.9%(60/78),特异性依次为81.8%(54/66)、84.8%(56/66)、87.9%(58/66)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c有较高的敏感性和特异性,对活动性肺结核的辅助诊断有一定的临床应用价值。

Rv3872/CFP-10/ESAT-6融合蛋白的人工合成及表达

根据牛分枝杆菌AF2122/97基因组中Rv3872、CFP-1O和ESAT-6全长基因序列,以柔性linke(rG4S)3,将三基因序列进行串联,形成表达基因盒(Rv3872-CFP1O-ESAT6,RCE),人工合成并克隆于PUC57转移载体上(PUC57-RCE)。经EcoRI和HindIII双酶切PUC57-RCE,回收纯化RCE片段,与经过相同双酶切的pET-28a载体,于16℃水浴连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,重组质粒经培养鉴定,测序结果证实插入的REC片段序列编码和方向与预期一致。在优化的诱导条件下表达蛋白,分段收集样本,并各取少量进行SDS-PAGE,经Western-blot分析显示,融合蛋白RCE具有较好的免疫原性,与阳性牛血清在35kDa位置处有明显的反应带。

结核分枝杆菌CFP-10单克隆抗体的研制与初步鉴定

目的:制备抗结核分枝杆菌CFP-10蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)-pET-30a(+)-lhp原核表达的融合蛋白His-CFP-10作为抗原免疫BALB/c小鼠,以纯化的融合蛋白GST-CFP-10作为检测抗原,制备抗结核分枝杆菌CFP-10mAb;采用间接ELISA、Dot-ELISA和Western blot鉴定mAb的特异性。结果:获得2株稳定分泌抗结核分枝杆菌CFP-10mAb的杂交瘤细胞株6E8、2E7,其Ig亚类分别为IgG1、IgG2b。mAb6E8、2E7腹水的ELISA效价分别为1∶1000000,1∶1024000。在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-CFP-10及GST-CFP-10的重组大肠杆菌反应,与其他5种菌株均不发生反应。在Westernblot试验中,2株mAb只与CFP-10蛋白发生反应,出现特异性条带。结果表明,mAb6E8、2E7是针对结核分枝杆菌CFP-10的特异性mAb。结论:成功地制备抗结核分枝杆菌CFP-10的mAb,它们在结核分枝杆菌诊断和致病机理研究等方面有重要应用价值。

牛分支杆菌CFP-10的原核表达及其在牛结核病诊断中的应用

低分子质量的蛋白抗原CFP-10是一种重要的牛分支杆菌早期分泌蛋白。为了检测该蛋白和其他几种抗原在牛结核病诊断中的临床应用,对CFP-10的基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达。PCR法扩增cfp-10基因片段,连接到pET-22b(+)原核表达载体中,再转入表达宿主E.coliBL21(DE3)PlysS菌株内,用IPTG诱导,进行蛋白表达、纯化。分别以CFP-10、ESAT-6、MPT83、MPT70、牛PPD、CFP-10与ESAT-6混合蛋白,MPT83与MPT70混合蛋白为抗原,用间接ELISA法诊断牛结核病。结果表明,以CFP-10与ESAT-6混合蛋白作为抗原检测牛结核病的特异性和敏感性分别达到了100%和63.6%,均超过了其他单抗原或抗原组合,为以筛选合适抗原为基础的血清学诊断技术提供了有力的支持并创造了良好的应用前景。

ESAT-6及CFP-10刺激颗粒酶B在儿童结核诊断中的价值

目的探究结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后颗粒酶B(GrB)水平对儿童活动性结核(ATB)的诊断价值。方法选取2019年1-8月武汉市金银潭医院和武汉儿童医院86例儿童,[ATB 26例、结核潜伏感染(LTBI)20例、非结核病对照(Non-TB)20例,健康对照(HC)20例],ELISA检测ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后GrB水平,流式细胞术检测表达GrB和干扰素-γ(IFN-γ)的CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例。结果ESAT-6/CFP-10刺激后结核组特异性GrB较对照组显著升高(P<0.001),且LTBI组显著高于ATB组(P<0.001)。CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞均可分泌GrB。结论结核特异性GrB对儿童活动性结核的鉴别诊断可能具有重要价值。

ESAT-6和CFP-10在感染性脊椎炎鉴别诊断中的作用

目的探讨结核感染T细胞试验(T-SPOT.TB)中两种抗原6 kD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)及10 k D培养滤过蛋白(CFP-10)在感染性脊椎炎鉴别诊断中的价值。方法回顾性分析2014年7月到2017年7月就诊于我院,完成T-SPOT.TB及相关检查,最终均通过血培养、病理组织学和脓液培养等手段明确病原学诊断的患者共59例(结核性脊椎炎38例、布鲁氏菌性脊椎炎11例和化脓性脊椎炎10例)。绘制ROC曲线并分析ESAT-6、CFP-10在不同类型感染性脊椎炎中的作用;应用kappa一致性分析检验ESAT-6、CFP10在结核性脊椎炎患者中诊断的一致性。结果 ESAT-6敏感度为84.2%、特异度为90.5%;CFP-10敏感度为76.3%、特异度为100%。两种斑点计数结果具有较高的一致性(kappa=0.660,P <0.05),但ESAT-6与病原学诊断结果一致性更高。结论 ESAT-6具有较高的可信度可运用于感染性脊椎炎的鉴别诊断。

结核杆菌CFP-10蛋白的原核表达、纯化及抗血清制备

目的:获得原核表达及纯化结核杆菌CFP-10蛋白及其抗血清。方法:从H37RV结核杆菌基因组中扩增得到CFP-10的编码基因,通过原核表达系统(BL21-pET28a+)表达及镍亲和层析和Q sepharose阴离子交换层析获得内毒素合格的CFP-10蛋白。将此蛋白免疫家兔,获得抗CFP-10的抗血清,并通过间接ELISA的方法检测其抗体滴度。结果:重组质粒pET28a-CFP-10构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得了高效表达,且经纯化获得了内毒素合格的CFP-10蛋白,免疫家兔获得的抗血清效价能达到1∶256 000。结论:成功的表达及纯化了CFP-10蛋白,并制备了高滴度的CFP-10抗血清,为临床血清学检测以及新型结核疫苗研究奠定基础。

参麦注射液对COPD合并肺结核患者细胞因子及ESAT-6/CFP-10水平的影响

目的探讨参麦注射液对慢性阻塞性肺疾病（COPD）合并肺结核患者细胞因子及ESAT-6/CFP-10水平的影响。方法选取本院呼吸科收治的COPD合并肺结核患者158例,按随机数字表法分组,对照组79例予以常规治疗,研究组79例在对照组基础上予以参麦注射液治疗,观察并记录2组间血清ESAT-6蛋白、CFP-10蛋白、IFN-γ水平、细胞因子水平、外周血免疫细胞水平,同时比较临床疗效及病灶吸收有效率。结果对照组临床总有效率（84.81%）低于研究组临床总有效率（94.94%）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;对照组病灶吸收有效率（87.33%）低于研究组病灶吸收有效率（96.21%）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;与对照组比较,研究组治疗后血清ESAT-6蛋白、CFP-10蛋白、IFN-γ水平较低,治疗后血清TNF-α、IL-6、s IL-2R水平较低,治疗后外周血NK细胞、CD4~＋T淋巴细胞及CD4~＋/CD8~＋水平较高,CD8~＋T淋巴细胞水平较低,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论参麦注射液能够明显降低COPD合并肺结核患者血清TNF-α、IL-6、s IL-2R及ESAT-6/CFP-10水平,改善细胞免疫功能,有效促进病灶吸收,提高临床疗效。

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a(+)为载体构建重组表达载体CFP-10/pET32a(+)。重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.9mmol/L IPTG37℃诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS-PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni-NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95%,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。