重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法,快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌,为净化牛结核病提供技术支撑。【方法】以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原,建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA,并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件。【结果】重组CFP-10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为:以8μg/mL重组CFP-10蛋白包为被抗原,37℃下包被1 h,再以5%脱脂奶封闭1 h,血清(一抗)经1∶200倍稀释后作用1 h,然后以1∶500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(二抗)作用1 h。该间接ELISA的阴阳临界值为0.281,仅与牛分枝杆菌呈阳性反应,与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应;其敏感性能检测1∶320倍稀释的血清,批内与批间的变异系数均小于5.0%。【结论】建立的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点,临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测。

结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的通过构建结核分枝杆菌(结核菌)CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His-Tag)镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果构建了含CFP-10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原,ELISA方法检测214份血清,阳性率达77.1%。结论目的基因克隆入宿主菌中并成功表达,重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His-Tag)镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。

ESAT-6/CFP-10融合蛋白的抗原性分析及其对诊断结核临床应用价值

目的分析ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为结核抗原的特性,并探讨以其作为抗原的酶联免疫斑点实验(ELISPOT)在结核诊断中的应用价值。方法以ESAT-6/CFP-10融合蛋白为刺激抗原的ELISPOT法(ESAT-6/CFP-10-ELISPOT)检测经结核特异性抗原刺激后分泌γ干扰素的效应T淋巴细胞数量方法,测定65例单纯结核病患者,16例HIV/结核双重感染患者,20例HIV感染患者,32例非结核呼吸道疾病患者,30名健康体检者外周血单个核细胞中结核菌抗原特异的T淋巴细胞的频率。结果 ESAT-6/CFP-10-ELISPOT与结核菌素皮肤试验(TST)在所有81例结核患者中的比较,ESAT-6/CFP-10-ELISPOT阳性率98.8%,TST阳性率为56.8%;ESAT-6/CFP-10-ELISPOT在涂阳结核组、涂阴结核组、HIV/结核双重感染组阳性率分别为100.0%、97.1%、100.0%,其敏感性远高于痰涂片检查,且各组结果差异无统计学意义;20例HIV感染组有1例阳性,非结核呼吸道疾病患者组与健康对照组均为阴性,提示ESAT-6/CFP-10-ELISPOT方法的特异度为98.8%。结论ESAT-6/CFP-10融合蛋白可以很好的刺激效应T淋巴细胞分泌γ干扰素,适合作为结核诊断中的特异性抗原,因而可以用于ELISPOT的检测,ESAT-6/CFP-10-ELISPOT对结核诊断有应用价值。

结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定

目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10,研究其免疫学特性,为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(+)中,构建pET32c(+)-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32c(+)的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(+)linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠肝菌BL21中表达,通过Westernblot分析其抗原性。结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c(+)的linker前或后。重组质粒pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Westernblot分析表明,融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c(+)-CFP10-ESAT-6或pET32c(+)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。

结核感染T细胞斑点试验对结核病治疗效果的监测价值

目的探讨结核感染T细胞斑点试验对结核病治疗疗效的监测意义。方法本研究采用T-SPOT.TB试剂盒,检测T细胞中γ-干扰素对结核分支杆菌特异性多肽类早期分泌性抗原靶标6-k D(ESAT-6)和培养滤液蛋白(CFP-10)的应答,对比113例结核感染者治疗前与治疗后T-SPOT.TB结果的变化,其结果根据对该试验中两种抗原的联合与各自应答来分析。结果 113例感染者在治疗后T-SPOT.TB结果转阴者有42例(37.2%)。其中,CFP-10转阴率占48.9%(P<0.001),ESAT-6转阴率占20.0%(P=0.238)。ESAT-6的斑点形成细胞(SFCs)/2.5×105外周血单核细胞(PBMCs)的平均数在治疗前和治疗后分别为18.47和16.29(P=0.16),而CFP-10的SFCs/PBMCs的平均数在治疗前和治疗后分别为22.83和15.31(P<0.01)。结论结核病治疗对于T细胞中γ-干扰素引起的ESAT-6和CFP-10抗原应答影响不同,CFP-10的定量应答才是结核病治疗的更有效监测手段。

应用酶联免疫斑点试验检测入伍新兵结核潜伏感染

目的 应用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测入伍新兵结核潜伏感染情况，评价ELISPOT在检测结核潜伏感染中的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）皮肤试验为对照，应用ELISPOT试剂盒检测366例2009年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结核菌抗原特异性y干扰素（IFN-y）的T淋巴细胞数。对PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗，10个月后再做PPD皮肤试验和ELISPOT，比较结果。结果366例入伍新兵中，PPD皮肤试验和ELISPOT阳性率分别为44．81％和31．69％。202例PPD皮肤试验阴性和164例PPD皮肤试验阳性者中，分别有53例（26．24％）和63例（38．41％）ELISPOT阳性，两者的一致率为57．92％（212／366），两者的检测结果差异具有统计学意义（X^2=14．34，P〈0．001）。在接种过卡介苗者中，PPD皮肤试验阳性率为58．53％（127／217），ELISPOT阳性率为29．1）3％（63／217），斑点形成细胞数为32．44±26．52；在未接种卡介苗者中，PPD皮肤试验阳性率为24．83％（37／149），ELISPOT阳性率为35．57％（53／149），斑点形成细胞数为41．81±30．48。110例PPD和ELISPOT均为阴性的人伍新兵接种卡介苗1（1个月后，PPD皮肤试验阳转率为78．18％，而ELISPOT检测均为阴性。结论ELISPOT具有较高的特异性和敏感性，能真实反映入伍新兵的结核潜伏感染情况，可推广应用。