去甲斑蝥素诱导CFPAC-1细胞凋亡及其与胞内[Ca^(2+)]i浓度的关系

目的研究去甲斑蝥素对人胰腺癌CFPAC-1细胞的促凋亡活性及其与胞内[Ca2+]i浓度的关系。方法流式细胞术检测细胞凋亡;琼脂糖凝胶电泳检测断裂DNA;激光共聚焦显微镜分析细胞内游离Ca2+浓度变化。结果 CFPAC-1细胞经去甲斑蝥素作用24h后,细胞凋亡率明显上升,且呈剂量依赖性,其基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈典型的梯状带型;CFPAC-1细胞内游离Ca2+浓度进行性升高。结论去甲斑蝥素触发的CFPAC-1细胞凋亡与胞内游离Ca2+浓度升高密切相关。

蛙皮素对人胰腺癌细胞系CFPAC-1细胞周期蛋白D_1/细胞周期蛋白依赖性激酶4的影响

背景:胃肠激素蛙皮素作为一种强有力的有丝分裂原,能刺激多种正常和肿瘤组织生长。目的:探讨蛙皮素对人胰腺癌细胞系CFPAC-1的促生长作用及其对细胞周期调控因子细胞周期蛋白(cyelin)D_1和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4的调节作用,以及蛙皮素促生长作用的机制。方法:用四唑蓝(MTT)比色法作为增殖指标,研究蛙皮素对CFPAC-1细胞生长的影响。用流式细胞仪观察蛙皮素对CFPAC-1细胞cyclin D_1表达的影响。用Western印迹和增强化学发光法(ECL)自显影观察蛙皮素对CFPAC-1细胞CDK4蛋白表达的影响。结果:一定浓度的蛙皮素对CFPAC-1细胞的生长具有促进作用,以1×10^(-10)mol/L蛙皮素的促生长作用最为明显(MTT OD_(570nm):蛙皮素1×10^(-10)mol/L组和对照组分别为0.652±0.155和0.359±0.109,n=3,P=0.002)。流式细胞仪检测发现,1×10^(-10)mol/L蛙皮素作用30min对CFPAC-1细胞cyclin D_1的表达有促进作用,但无显著统计学差异(P>0.05)。Western印迹和ECL自显影结果表明,1×10^(-10)mol/L蛙皮素作用15min可使CFPAC-1细胞CDK4蛋白表达升高,而后逐渐下降。结论:蛙皮素对CFPAC-1细胞的促生长作用部分是通过蛙皮素介导的细胞周期调控因子cyclin D_1/CDK4蛋白表达升高,从而促进细胞周期进展而实现的。

慢病毒绿色荧光蛋白感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率观察

目的:观察慢病毒-绿色荧光蛋白(Lentivirus-green fluorescent proteins,慢病毒-GFP)感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率,为后继的利用慢病毒载体来介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)实验作准备。方法:应用慢病毒-GFP感染CFPAC-1细胞,在感染后不同的时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况并计算感染效率。结果:慢病毒-GFP感染CFPAC-1细胞从60～72小时开始可见明显的绿色荧光,在感染复数(multiplicity of infection,MOI)=10时,CFPAC-1细胞的慢病毒感染效率在60小时左右可达80%以上,72小时～7天基本能够达到90%的感染效率,在此后4周内作连续观察,感染效率仍维持在80%～90%。结论:慢病毒可稳定感染人胰腺癌细胞株CF-PAC-1,且效率高,可作为载体对该细胞株进行RNAi实验。

siRNA沉默EphB2表达对胰腺癌CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,靶向沉默人胰腺癌CFPAC-1细胞中的EphB2基因的表达,观察EphB2对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建靶向EphB2基因的siRNA干扰质粒,通过Lipofectamine^(TM)2000将干扰质粒转染进293T细胞,筛选出能有效抑制EphB2蛋白表达的干扰序列。构建含有效序列的慢病毒载体pLentiGFP-EphB2,感染CFPAC-1细胞,筛选出稳定干扰EphB2蛋白表达的CFPAC-1细胞系。定量PCR、Western blotting检测CFPAC-1细胞中EphB2mRNA和蛋白的表达,CCK8法和流式细胞术检测EphB2下调对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响。结果:成功构建了EphB2慢病毒干扰载体pLentiGFP-EphB2,获得稳定转染pLentiGFP-EphB2的CFPAC-1细胞(CFPAC-1 EphB2 RNAi)。CFPAC-1EphB2 RNAi细胞中EphB2 mRNA和蛋白表达较空载体组显著降低,EphB2 mRNA的沉默效率为63%。与空载体组和未转染组相比,pLentiGFP-EphB2感染显著促进CFPAC-1细胞的增殖(1.89±0.17vs1.63±0.13、1.71±0.22,P<0.05),抑制细胞的凋亡[(7.02±1.27)%vs(13.37±1.89)%、(15.71±2.35)%,P<0.05]。结论:pLentiGFP-EphB2可有效下调胰腺癌CFPAC-1细胞中EphB2的表达,促进CFPAC-1细胞增殖和抑制其凋亡。

南瓜蛋白对人胰腺癌细胞CFPAC-1增殖抑制及诱导凋亡作用

目的探讨南瓜蛋白(CUS)体外对人胰腺癌细胞CFPAC-1的增殖抑制及诱导凋亡作用。方法甲基噻唑基四唑法检测南瓜蛋白对CFPAC-1细胞的增殖抑制作用,透射电镜观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,蛋白质印迹法检测caspase-3及bcl-2蛋白表达水平。结果不同浓度(0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1及2μmol.L-1)南瓜蛋白作用不同时间(24、48及72 h)后,南瓜蛋白对胰腺癌细胞有增殖抑制作用,并呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。1μmol.L-1南瓜蛋白作用72 h后,电镜下可见明显凋亡改变,并可见凋亡小体。流式细胞仪结果示,与对照组相比,S期细胞减少,G0/G1期细胞增多,细胞由G0/G1期进入S期延缓;不同浓度(0、0.062 5、0.25及1μmol.L-1)南瓜蛋白作用72 h后细胞凋亡率分别为(0.33±0.37)%、(19.26±1.49)%、(37.13±2.07)%及(55.64±2.91)%。随着药物浓度的增高,caspase-3蛋白表达逐渐增强,bcl-2蛋白表达逐渐减弱。结论南瓜蛋白对人胰腺癌细胞CFPAC-1具有明显抑制作用;南瓜蛋白可能通过上调caspase-3及下调bcl-2蛋白表达诱导胰腺癌细胞凋亡。

马钱子碱通过调控线粒体凋亡途径诱导人胰腺癌CFPAC-1细胞凋亡

目的探讨马钱子碱对人胰腺癌CFPAC-1细胞凋亡的影响及其可能机制。方法以不同浓度马钱子碱干预CFPAC-1细胞。采用MTT比色法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡;采用花青染料(JC-1)染色法检测细胞线粒体膜电位的变化;采用蛋白质印迹法检测Bax、B cl-2蛋白表达情况。结果〇(对照组)及〇.4、0.8 m m ol/L马钱子碱组干预CFPAC-1细胞24、48、72 h后,细胞增殖抑制率分别为0;(30.23±0.55)%、(40.61±0.15)%、(46.98±1.27)%;(50.17±0.75)%、(61.23±0.91)%、(70.32±0.40)%,呈浓度及时间依赖性增加而升高,显著高于对照组,且不同时间两两组间比较差异均有统计学意义(/>值均<〇.〇5)。〇及0.4、0.8 mmol/L马钱子碱干预CFPAC-1细胞48 h后,细胞凋亡率分别为(2.92±0.46)%、(4.64±1.31)%、(13.09±0.65)%,随药物浓度增加而逐渐升高,其中0.8 mm ol/L干预组显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);随着药物浓度的增加,呈红色荧光的未凋亡活细胞逐渐减少,而呈绿色荧光的凋亡坏死细胞逐渐增多,提示CFPAC-1细胞线粒体膜电位受到重度破坏而降低;CFPAC-1细胞的B d-2蛋白表达量分别为(0.92±0.12)、(0.67±0.14)、(0.35±0.14)mmol/L,Bax蛋白表达量分别为(0.56±0.12)、(0•85±0.10)、(1.15±0.12)m m ol/L,随马钱子碱浓度增加,Bcl-2表达量显著下调,而Bax表达量显著上调,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论马钱子碱可能通过线粒体凋亡途径上调Bax和下调Bcl-2表达,从而诱导人胰腺癌CFPAC-1细胞凋亡。

吉西他滨白蛋白纳米粒对胰腺癌细胞株体外抑制效应的实验研究

目的:通过体外实验,探讨406nm吉西他滨白蛋白纳米颗粒(406nm-GEM-NP)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1体外增殖的抑制效应。方法:以人胰腺癌细胞株CFPAC-1为研究对象,分为4个给药组:406nm-GEM-NP组、单纯GEM组、空白纳米颗粒组和无药对照组,采用MTT法(四甲基偶氮唑蓝)观察不同药物浓度对肿瘤细胞生长的抑制作用;并同时观察给药后48h和72h肿瘤细胞的增殖抑制率。结果:MTT试验检测提示406nm-GEM-NP和GEM均具有显著的细胞抑制作用,且406nm-GEM-NP的细胞抑制率在50μg/mLGEM浓度时,超过了单纯GEM(P<0.05),且有明显的时间依赖性,提示有显著的药物缓释作用;空白纳米颗粒对细胞抑制轻微,且不具有时间和浓度依赖性。结论:406nm-GEM-NP对人胰腺癌细胞株CFPAC-1具有显著的体外细胞增殖抑制作用。

Plk1在胰腺癌中的表达及临床意义

目的 研究胰腺癌组织标本及细胞系中Plk1的表达及临床意义。方法 应用免疫组化EnVision两步法检测33例胰腺癌及其癌旁组织、3例胰腺浆液性囊腺瘤、3例黏液性囊腺瘤、5例慢性胰腺炎的石蜡标本中Plk1的表达。用半定量RT—PCR检测5例新鲜胰腺癌组织及其癌旁组织中Plk1 mRNA的表达。用Westernblot检测两株胰腺癌细胞PANC1和CFPAC1中Plk1表达。结果 胰腺癌组织中Plk1的阳性表达率为72、7％（24／33），其表达与胰腺癌患者的年龄、性别、临床分期、组织学分级、淋巴结转移、肿瘤的部位无显著相关（P〉0.05）。癌旁组织、慢性胰腺炎和良性胰腺肿瘤组织中Plk1的表达均为阴性。5例新鲜胰腺癌组织中都有Plk1mRNA的高表达，两株胰腺癌细胞中也有Plk1蛋白的表达。结论 Plk1在胰腺癌中的表达具有一定肿瘤特异性，有可能成为胰腺癌诊治的理想靶标。