运用CFSE和PKH26双染法快速鉴定细胞外囊泡

目的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)称为细胞间“信使”,通过传递物质和信息调控受体细胞的功能和表型,在生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用。然而,亚微米直径、高异质性、低折射率等特性使EVs的分析鉴定严重受阻。本研究旨在探索一种准确、高效的EVs流式检测方案,为EVs的功能研究提供技术支撑。方法首先采用差速离心法分离获得EVs,用已知直径的聚苯乙烯微球作为标尺,对流式细胞仪检测EVs的各项参数进行调试和优化以达到最佳信噪比;梯度稀释EVs样本,优化其上样浓度以降低群检测效应(swarming effect),在此基础上进一步用PKH26和CFSE两种荧光染料对EVs脂膜和蛋白进行双荧光标记,从而实现对EVs物理和生化特性的多参数分析,最后通过特异性抗体标记、电镜观察、纳米颗粒跟踪分析对EVs样本进行验证分析。结果参数优化后的流式细胞仪在散色光通道能将80 nm的微球信号与仪器背景噪音信号清楚分开;通过对样本的梯度稀释建立的浓度与稀释倍数之间的标准工作曲线的相关系数达0.99以上,说明仪器可以对EVs进行定量分析;荧光染色显示EVs呈CFSE及PKH26双阳性,占比约5.46%,与抗体标记的结果相近;电镜和纳米颗粒跟踪分析验证其粒径及群体分布与流式结果一致。结论联合散射光与脂膜荧光染料标记是一种经济、高效的EVs流式检测方案,有利于EVs流式分析的标准化。

体外标记CFSE对BV-2细胞活率的影响

探究荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)在不同使用浓度和孵育时间下对BV-2细胞系的影响。方法:采用0、1、2、5、10μmol/L的CFSE标记BV-2细胞系,染料孵育时间分别为10、20、30min,采用流式细胞术检测细胞的阳性率和荧光强度,采用CCK-8法检测在孵育时间为10min的条件下不同浓度CFSE对于24h后细胞活率的影响;选出合适的浓度后CCK-8法检测该条件下的最佳孵育时间,结果:随着CFSE标记浓度提高,细胞标记率也随之提高,而CFSE孵育时间的延长对细胞标记率无明显改变且使细胞活率下降,孵育20和30min对细胞活率有影响(P<0.05),在细胞标记率接近100%后,提高CFSE的浓度,对细胞的活率也有影响,10μmol/L浓度的CFSE孵育10min就降低了细胞的活率。因此,在本研究实验条件下,体外标记浓度5μmol/L并孵育10min可能是CFSE染料标记BV-2细胞的最适条件。

BrdU,CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较

目的:研究BrdU,CFSE和GFP作为大鼠间充质干细胞标记物的可行性.方法:分别用上述三种标记物标记大鼠间充质干细胞,检测即时、15和30d的标记率,通过检测细胞周期、凋亡率和描绘生长曲线,来明确标记物对体外培养大鼠间充质干细胞生长特性的影响;通过流式细胞仪检测标记物对细胞表面标志(CD29,CD34,CD44,CD45)表达的影响.结果:BrdU,CFSE,GFP的即时标记率为77.0%,99.4%,89.7%,1mo后分别下降至51.9%,77.5%,82.9%.三者对体外培养的大鼠间充质干细胞的生长特性和表面标志的表达均无明显影响.结论:GFP,BrdU和CFSE均可以作为大鼠间充质干细胞的标记物.

荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究

探讨荧光染料CFSE在作为细胞标记时的特性。方法 :应用激光共聚焦扫描显微术 ,观察CFSE在细胞中的准确定位。利用MTT比色法测定CFSE标记的细胞及未标记细胞的增殖情况 ;通过细胞计数和流式细胞仪 (FCM) ,测定细胞在不加任何刺激及诱导的情况下细胞数及平均荧光强度的变化趋势。结果 :在共聚焦显微镜下 ,可见CFSE标记的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中都带有绿色荧光 ,以胞核荧光最强。利用MTT比色法测定标记及未标记细胞的A值无显著差异。连续 6d记录的细胞数与FCM测定的平均荧光强度呈负相关。结论 :CFSE可作为细胞的标记物 ,用于细胞移植的体内检测。

荧光染料CFSE标记大鼠间充质干细胞的体外研究

目的探究荧光染料CFSE对大鼠间充质干细胞细胞(MSCs)标记的理想条件及跟踪时限。方法采用终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L的CFSE在1、5、10min三个不同的时间点标记MSCs,用流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞的转染率和荧光强度,以此来筛选CFSE标记MSCs的理想条件;采用MTT方法检测在此理想条件下CFSE对MSCs的增殖是否有影响;用流式细胞仪和荧光显微镜检测在此理想条件下CFSE跟踪MSCs的最大时限。结果终浓度为20.0μmol/LCFSE作用5min为CFSE标记MSCs细胞的理想条件,在此理想条件下MSCs细胞的荧光强度能跟踪到第21天时与未标记细胞的荧光强度相接近,并且此理想条件下的CFSE对MSCs细胞的增殖无影响(P>0.05)。结论在体外正常的培养条件下终浓度为20.0μmol/LCFSE作用5min为其标记MSCs细胞的理想条件,在此理想条件下的CFSE能够跟踪MSCs细胞的最大时限为21d。

CFSE标记抗原特异性CD4^+CD25^+T细胞在胰岛移植体内归巢的研究

目的:观察抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在小鼠同种异体胰岛移植后体内的分布特点,探讨抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞免疫调节可能机制。方法:构建小鼠同种异体胰岛移植模型。CFSE对抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞标记,经尾静脉输注。用组织冰冻切片和流式细胞术动态了解CFSE标记的抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在受体内的分布和增殖变化。结果:抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.57±17.15)d,较胰岛移植组生存时间(10.6±1.82)d,差异有统计学意义(P<0.01)。抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在各级淋巴结均有能定居,但是胰腺淋巴结定居的细胞数量明显多于其他淋巴结。结论:抗原特异性Treg细胞抑制STZ诱导的糖尿病小鼠的急性移植排斥反应,细胞抑制功能与细胞在体内淋巴结的归巢有关。

CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响

目的利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu-orescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。方法环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用CFSE染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。结果对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27.17h和22.88h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31.53h和43.32h。结论通过数学拟合法对CFSE数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。

CFSE标记技术及其在细胞研究中的应用进展

近年来活体染料CFSE已被广泛应用,其作用机制也逐渐阐明。它不仅应用于细胞增殖的体外实验,也可用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程,为细胞免疫和细胞生物学研究开辟了一条新的有效途径。本文综述了活体染料CFSE的性质、工作原理及应用。

CFSE标记技术的研究进展

羧基荧光素乙酰乙酸（CFSE）标记细胞与流式细胞仪相结合的技术在免疫学领域应用越来越广泛。该技术已经由淋巴细胞扩展到应用于肿瘤细胞、干细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）甚至是细菌的研究,由检测细胞增殖拓展到体内示踪等研究。此外,对于该项技术的热点还集中在对其数据的分析、与传统方法的比较以及标记的方法的研究。尤其是对细胞增殖的结果的定量分析已经成为生物数学领域的一个热点,也为机制研究提供了更丰富的信息。羧基荧光素乙酰乙酸具有动态检测细胞增殖动力学,在单细胞水平上供信息等优势,有替代传统方法（如^3H掺入法、MTT法等）的趋势。

利用CFSE标记检测CD8^+淋巴细胞增殖

[目的 ]介绍一种新的检测淋巴细胞增殖的方法。 [方法 ]用本室构建的重组蛋白疫苗hsp6 5-CAP3对C5 7小鼠进行 3次免疫后 ,分离小鼠的脾细胞 ,以照射灭活的CAP3转基因细胞为刺激细胞 ,在体外刺激淋巴细胞的增殖反应。淋巴细胞在与刺激细胞共培养之前用绿色荧光染料羧乙基锗倍半氧化物 (CFSE)进行标记。在共培养 72h后 ,用PE标记的抗鼠CD8分子的单抗标记淋巴细胞。收集细胞进行FACS检测 ,出现在二维点图左上象限的细胞代表CFSE含量减少的CD8+淋巴细胞 (CD8+CFSElow)即增殖的CD8+淋巴细胞 ,利用流式细胞仪记数左上象限CD8+CFSElow细胞的比例。 [结果 ]经体外刺激的脾淋巴细胞中 ,实验组CD8+CFSElow的平均百分比值为 (16 .4 7± 2 .10 ) % ,对照组CD8+CFSElow 的平均百分比值为 (7.6 9± 1.6 5 ) % (P <0 .0 5 )。 [结论 ]通过FACS结果判定CD8+淋巴细胞发生了特异性的增殖。CFSE标记是一种有效的检测淋巴细胞增殖的方法。

基于CFSE染色的小鼠淋巴细胞体内示踪方法的建立

目的确定CFSE标记小鼠淋巴细胞的条件,建立简单快速、稳定可行的淋巴细胞体内示踪方法。方法利用流式细胞术分别检测不同浓度CFSE、不同悬浮溶液(1640培养基、PBS溶液)对小鼠淋巴细胞标记效果的影响,确定合适的标记条件;输注同品系CFSE标记的小鼠淋巴细胞,于不同时间点检测受鼠主要脏器内CFSE+细胞在淋巴细胞中的比例,并确定供鼠细胞的注射剂量;按照合适的注射剂量分别在注射后不同时间点测定供鼠细胞在受鼠体内的分布,考察本方法的稳定性及阳性信号的持续时间。结果 PBS组CFSE+细胞平均荧光强度分别为596、793、1123、1596、1737,明显高于1640培养基组(P<0.05);1640培养基组CFSE+细胞死亡率分别为8.7%、8.4%、8.6%、9.0%(P>0.05),而PBS组CFSE+细胞死亡率随着CFSE终浓度的上升而增加(P<0.05);按照不同剂量输注同品系淋巴细胞24h后,在受鼠各组织中检测到CFSE+细胞;每只小鼠尾静脉注射5×106个CFSE+淋巴细胞后,到d63仍可在组织中检测到阳性信号细胞。结论以PBS作为孵育液、CFSE终浓度选择10μmol/L对小鼠淋巴细胞标记、注射剂量为细胞5×106个/只,可使CFSE+细胞信号在同系小鼠体内持续2个月。

CFSE标记结合流式细胞术在研究NK细胞分裂与杀伤功能中的应用

目的建立并优化CFSE标记结合流式细胞术检测人NK细胞分裂、增殖和杀伤功能的方法。方法利用CFSE标记磁珠纯化的人NK细胞,加或不加IL-2进行培养。分别在第3、5、7天收集细胞,流式细胞术对NK细胞的分裂增殖进行检测;利用IL-2活化NK细胞作为效应细胞,与靶细胞(K562细胞)按不同效靶比在37℃5%CO_2培养箱共孵育4 h加入碘化丙啶(PI),流式细胞术检测CFSE^+PI^+K562细胞(死亡的靶细胞)的百分率。结果CFSE标记的NK细胞在IL-2的作用下第5天即可观察到细胞增殖,至第7天80%以上的NK细胞均发生增殖,分裂1～6次。在对NK细胞杀伤功能的研究中,发现IL-2刺激后NK细胞的杀伤功显著增强。此外,当IL-2或IL-12活化的NK细胞作用于不同的靶细胞时,均可有效地杀伤靶细胞。结论以CFSE标记技术结合流式细胞术可在单细胞水平客观精确地对NK细胞的增殖、分裂和杀伤功能进行分析。本方法灵敏度高、操作简便易行、重复性好,对其他淋巴细胞亚群功能的研究具有重要的借鉴意义。

CFSE标记细胞的影响因素探讨

目的探讨影响CFSE标记细胞效果的多种因素。方法用不同配制时间、不同浓度的CFSE标记不同浓度的HL60细胞、MCG803细胞以及人淋巴细胞。结果配制的CFSE在存放2年以后标记率下降12．32％；在10μmol／L范围内细胞标记率与CFSE浓度成正比；低浓度细胞的标记率比高浓度的更高；同等条件下HL60细胞的标记率高于MCG803细胞；细胞的异质性使同一群细胞的标记率发生差异；散点图比直方图更适合CFSE标记细胞的传代分析。结论2．5～5μmol／L的CFSE是理想的标记浓度,10^6／mL是合适的标记细胞浓度。均一的细胞是高质量标记的关键。

用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性

目的研究荧光染料CFSE和Brdu作为体内细胞移植标记物的实用性。方法构建猪急性心肌梗死(AMI)模型。用CFSE和Brdu对骨髓单个核细胞进行双标记,经冠状动脉回输至MI区。4周后,利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的定位和标记情况。结果细胞移植4周后,发现Brdu阳性细胞多位于心肌疤痕形成区且MI区的新生血管内壁也出现阳性染色。在MI区可见CFSE标记的带绿色荧光的细胞,但背景色较高。结论在动物实验中,CFSE和Br-du均可作为移植细胞标记物,Brdu的标记效果优于CFSE,适于同时进行形态学和组织学研究。

基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立

目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。方法:用终浓度分别为3、6、9和12μg/ml的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。结果:不同浓度ConA刺激后,猪PBMC增殖能力不同,ConA浓度为6μg/ml时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT试验也获得相似结果。对PBMC刺激5天后进行分析相对较好。结论:建立了一种基于活细胞染料CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。

荧光染料CFSE检测淋巴细胞增殖的研究

目的 评价荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)用于淋巴细胞及其亚群增殖状况追踪的效果。方法 利用荧光染料CFSE作为细胞标记,结合荧光标记的抗体,通过流式细胞仪检测淋巴细胞及其亚群体外增殖情况。结果该方法不仅可以测定淋巴细胞及其亚群的增殖情况,而且可以估算细胞分裂的周期。结论 荧光染料CFSE是一种可以监测淋巴细胞及其亚群增殖状况的很好的示踪剂。

荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞体内示踪方法

背景:利用荧光染料标记活细胞体内示踪的方法较多,但是应用荧光染料浓度差异实现不同细胞体内示踪的方法目前仍不成熟。目的:观察不同浓度荧光活性染料CFSE标记的小鼠脾细胞体内示踪情况,建立稳定的单染料差异浓度标记活细胞的体内示踪方法。方法:取C57BL/6J及BALB/c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度CFSE染色后制备1∶1混合细胞悬液;锥虫蓝染色鉴定细胞活性;将染色的混合细胞输注BALB/c小鼠后不同时间点,流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例。结果与结论:CFSE标记的小鼠脾细胞活力良好,荧光显微镜下见全部细胞标记后均发绿色荧光,形态正常,CFSE标记阳性率为95%。CFSE染色时,在浓度相差20倍时流式直方图才显示为两个完全独立的峰,即CFSE低浓度用0.3μmol/L高浓度用6μmol/L。异基因的C57BL/6J脾细胞在输注1d后就快速消失,而同基因BALB/c脾细胞能够在BALB/c小鼠外周血中长期存在,但是两种细胞荧光强度均未见降低,说明荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞进行体内示踪是一种稳定的示踪方法。

CFSE荧光负染法检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞摄取超顺磁性氧化铁纳米粒子

目的:探讨CFSE荧光负染法用于检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞吞噬超顺磁性氧化铁纳米粒子(super paramaganetic iron oxide nanoparticles,SPIO)的可行性及其荧光特征。方法:体外对RAW264.7细胞进行SPIO的标记,然后分别采用普鲁士蓝染色方法和CFSE荧光负染法检测RAW264.7细胞对SPIO的摄取情况;用台盼蓝染色法检测CFSE荧光负染细胞的活力;应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光负染法检测RAW264.7细胞对SPIO的摄取。结果:普鲁士蓝将RAW264.7细胞内吞噬的SPIO标记为醒目的蓝色,核固红将细胞核标记为红色,在荧光图像上表现为荧光负染区,呈筛孔状。CFSE荧光负染法与普鲁士蓝染色法的检测结果具有很好的对应性。RAW264.7细胞经过SPIO和CFSE双重标记后,对细胞活力的影响较小,死细胞比例较低。结论:CFSE荧光负染法可用于RAW264.7活细胞吞噬SPIO的检测,同普鲁士蓝染色法具有很好的对应性,两者的检测结果可相互印证。

CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法的建立

目的:以流式细胞术(FCM)检测马传染性贫血病毒(EIAV)抗原特异性的T淋巴细胞增殖。方法:将新鲜分离的马外周血单个核细胞(PBMC)进行CFSE染色,经纯化病毒体外刺激并培养5d后,进行T淋巴细胞亚型标记,检测特异性增殖的CD4+和CD8+细胞比例。结果:对马PBMC的染色浓度、特异性刺激物的种类及反应时间等条件进行了优化。可对马外周血抗原特异性T淋巴细胞不同亚型的增殖水平进行定量评价。结论:FCM检测方法为研究马传染性贫血病毒疫苗免疫保护机制提供了一个有效的手段;该法也可以为其他病毒的免疫学研究提供借鉴。

CFSE标记人T细胞亚群增殖反应及其在病毒感染性疾病中的应用

目的探讨应用流式细胞术和活体染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人T细胞亚群增殖反应的方法学及其在病毒感染性疾病中的应用价值。方法用不同浓度的CFSE标记新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC),分为未刺激组及刺激组。未刺激组加入CD28,刺激组加入CD28及不同浓度PHA,将细胞培养5～7d后进行染色,采用流式细胞仪检测,观察CFSE、PHA标记的最佳浓度及最佳培养时间,采用CellQuest软件及ModFit软件分析T淋巴细胞各亚群的增殖情况,并对两种分析方法进行比较,在上述最佳实验条件下,采用相同的实验方法分析CMV-pp65肽刺激CMV-IgG(+)HLA-A2(+)者外周血单个核细胞(PBMC)后T细胞亚群增殖情况;结果CFSE标记人外周血单个核细胞(PBMC)的最佳浓度是0.5μmol/L,PHA的最佳刺激浓度为2μg/ml,在此浓度下,最佳培养时间为6d,PHA刺激培养6d后T细胞各亚群出现典型的增殖不同步现象,经CMV-pp65肽刺激后CD8+T细胞出现明显的增殖反应,采用CellQuest及ModFit软件联合分析,可实现淋巴细胞增殖分析的可视化及数量化。结论CFSE染色结合荧光抗体标记和流式细胞术是分析淋巴细胞增殖的有力工具,可以有效检测出病毒抗原刺激后T淋巴细胞各亚群的增殖反应及增殖动力学,在探讨病毒感染性疾病的发病机制中具有重要价值。