抗菌肽CGA-N46对皮肤感染克柔念珠菌小鼠的治疗作用

为研究抗菌肽CGA-N46对皮肤感染克柔念珠菌小鼠的治疗效果,用克柔念珠菌感染免疫抑制小鼠制备感染模型,采取皮肤病变观察、皮下脓疱液和痂皮分离真菌,确定建模是否成功。对克柔念珠菌感染小鼠模型分别涂抹4 mg/mL和8 mg/mL CGA-N46进行治疗,以成活率、有效率和组织病理变化判断CGA-N46治疗效果。结果表明,以2×108 CFU/mL克柔念珠菌菌悬液感染表皮可建立感染模型;4 mg/mL和8mg/mL CGA-N46均能提高克柔念珠菌感染小鼠成活率,对克柔念珠菌皮肤感染有缓解作用,其中8mg/mL CGA-N46治疗效果更好。结果证实,CGA-N46对克柔念珠菌临床感染有治疗效果,具有开发成新型抗真菌药物的潜力。

抗真菌活性肽段CGA-N46的免疫学鉴定及其高效表达条件研究

[目的]嗜铬粒蛋白Chromogranin AN端31-76位氨基酸组成的多肽CGA-N46具有较强的抗真菌活性,对其表达条件进行研究具有重要意义。[方法]将CGA-N46基因重组大肠杆菌BL21(DE3,pET-N46)接种于含有氨苄青霉素的2×YT培养基中,于37℃、230r/min振荡培养3 h后加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L,25℃条件下诱导6 h,离心收集菌体进行SDS-PAGE蛋白电泳。利用抗6-His的单克隆抗体进行免疫印迹,结果有免疫印迹条带,但表达量不高。鉴于此,对CGA-N46基因的表达条件进行了优化。[结果]在37℃下培养3 h后加入IPTG25℃诱导9 h,目的蛋白表达量较高,当诱导剂IPTG的浓度超过0.4 mmol/L时,其浓度的改变对目的蛋白的表达没有多大影响。

CGA-N46基因大肠杆菌工程菌的构建与表达

嗜铬粒蛋白N端31-76位氨基酸组成的多肽CGA-N46具有很强的抑制白念珠菌活性,具有重要的研究价值。通过基因工程技术构建了能表达CGA-N46蛋白的大肠杆菌工程菌BL21(DE3,pET-N46),诱导表达后,进行SDS-PAGE及western-blotting。结果表明在IPTG诱导下,CGA-N46蛋白基因在BL21(DE3,pET-N46)中获得表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在。

动物内源性多肽CGA-N46对念珠菌细胞增殖的影响

CGA-N46是人嗜铬粒蛋白N端具有抗真菌活性的多肽片段。采用MTT法检测CGA-N46对克柔念珠菌生长的抑制作用,以β-1,3-葡聚糖酶活性检测克柔念珠菌细胞壁的完整性,采用PI检测克柔念珠菌细胞膜通透性,用罗丹明123检测线粒体膜电位。试验结果证实,0.5 mg/mL的CGA-N46能够明显抑制克柔念珠菌的细胞增殖能力;对其细胞壁的完整性及细胞膜的通透性没有影响;CGA-N46能明显降低线粒体膜电位。推测CGA-N46可能通过影响线粒体膜电位来抑制克柔念珠菌的生长。

动物内源性多肽CGA-N46生物信息学分析

抗菌肽是存在于动植物、昆虫、微生物等生物体内,具有抗菌活性的肽类物质。CGA-N46是一种抗真菌多肽。利用生物信息学工具分析CGA-N46,发现CGA-N46等电点为7.38,分子质量为5.363ku,为亲水蛋白,二级结构为α螺旋,有两个磷酸化位点,无糖基化位点、信号肽序列和跨膜区。通过对CGA-N46结构与性质的分析,推测其可能作用于细胞壁或某些生物分子,致使菌体死亡。

抗真菌肽CGA-N46基因多顺反子表达载体的构建与鉴定

目的:为提高抗真菌肽CGA-N46表达量,对该基因多顺反子表达进行研究。方法:以pEASY-Blunt为克隆载体,以"pET-30a rbs序列-起始密码子-CGA-N46编码序列-终止密码子"为外源片段,利用同尾酶Nhe I、Spe I和Xba I,构建了含有上述外源片段1、3、5、8拷贝的重组载体pT-CAN46、pT-3CAN46、pT-5CAN46和pT-8CAN46;将pEASY-Blunt上的外源基因片段亚克隆至pET-30a的rbs序列下游,构建了CGA-N46基因1、3、5、8顺反子的重组表达载体pET-CAN46、pET-3CAN46、pET-5CAN46和pET-8CAN46;利用感受态转化法转化大肠杆菌Rosetta,进行了表达研究。结果:在IPTG诱导下,CGA-N46基因1、3、5、8顺反子重组表达载体均能表达CGA-N46单体,各重组表达载体表达CGA-N46的量在总蛋白中的百分含量分别为3.4%、5.0%、12.4%、17.1%。结果表明随着CGA-N46基因顺反子个数的增加,外源蛋白表达量也越来越多。其中,8顺反子表达量最高,实现了CGA-N46的高效表达。结论:多顺反子表达可以克服融合表达和串联表达肽类蛋白的不足;创建的多顺反子表达载体构建方法简化了传统基因工程构建方法的步骤,为基因工程有效提高小肽表达量奠定了基础。

动物内源性多肽CGA-N46抗菌谱及对动物细胞的作用

目的研究抗真菌肽CGA-N46的抗菌谱及对不同动物细胞的作用效果。方法采用微量稀释法测定CGAN46对14种常见病原真菌的抗菌活性;采用分光光度法检测CGA-N46对红细胞的溶解作用,采用MTT法测定CGAN46对鸡胚成纤维细胞的毒性作用及对癌细胞的抑制作用。结果 CGA-N46对光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、白念珠菌具有抑菌活性,其MIC分别为4.0、4.0、0.5、1.0、1.0mg/ml;最小抑菌浓度的CGA-N46无溶血作用,对鸡胚成纤维细胞无毒性,但对肺癌A549细胞有抑制作用,72h最大抑制率为60.53%。结论 CGA-N46多肽具有抗念珠菌作用,且具有抗癌潜力,而对正常细胞安全、无毒性。