青蒿查尔酮合成酶(AaCHS)基因家族鉴定及光调控分析

[目的]为了解青蒿(Artemisia annua L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因家族的分子进化特性及其在不同组织部位的表达情况。[方法]从Pfam数据库下载CHS蛋白HMM模型,并使用HUMMER 3.0、Blastp和CD-search鉴定出青蒿基因组中的CHS基因家族成员。采用TBtools、EXPASy、CELLO v.2.5、MEGA 7.0、MEME、SOPMA、SWISSMODEL和PlantCARE等软件对其氨基酸与碱基序列进行生物信息学分析,通过8个不同组织部位的转录组数据对AaCHS基因家族成员进行表达分析。[结果]青蒿基因组中共有16个AaCHS基因家族成员,蛋白结构分析显示AaCHS蛋白质结构并不稳定,将其分为4个组,基因结构分析显示所有AaCHS基因蛋白均具有外显子,数量为2~4,内含子数量为0~2,其中8个AaCHS基因不具有内含子。启动子顺式作用元件分析表明该基因家族成员启动子上含有大量光响应、植物激素响应元件;CD-search验证结果发现每个AaCHS蛋白均有Chal-sti-synt_N结构域。[结论]AaCHS家族成员表达分析结果表明,16个AaCHS基因在不同组织和光处理下表达不同。GO富集结果得到GO二级分类的生物过程和分子功能,生物过程共富集了80条序列;细胞组分共富集了19条序列,其中二级分类过程细胞质中富集了11条序列,数量最多,与亚细胞定位预测结果一致;推测AaCHS基因在细胞质中调控黄酮类化合物的累积。通过青蒿光调控差异表达分析,推测AaCHS7、AaCHS10在青蒿受到红光光处理中起正向调控作用。

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。

采后硅酸钠处理及损伤接种对厚皮甜瓜CHS基因的诱导表达

以厚皮甜瓜品种"银帝"为试材,根据黄瓜查儿酮合成酶(CHS)基因设计引物,运用半定量RT-PCR技术,研究了采后100mmol·L-1硅酸钠浸泡处理对甜瓜果实CHS基因表达的影响.结果表明:PCR扩增所得片段(494bp)与黄瓜CHS基因同源,相似性为94%,可用于半定量RT-PCR分析;CHS基因在处理和对照中的表达丰度极低,无法检测;损伤接种T.roseum后第4d,CHS基因大量表达,且硅酸钠处理+损伤接种与对照+损伤接种差异达到最大,前者高出后者12%.

石笔木CHS基因家族成员的分析

用PCR方法从石笔木 (TutcheriaspectabilisDunn)的总DNA中扩增CHS基因外显子 2的部分序列以代表该基因进行研究 ,经克隆后测序 ,得到长约 74 0～ 780bp的序列共 12个。以EMBL数据库中得到的紫花苜蓿和欧洲赤松各一个序列作为参照 ,进行排序和系统树的构建分析。结果显示 ,所有被测定的序列同源性均高于 70 % ,为CHS基因家族的成员 ,且这些序列由 3大类共 5种不同的基因拷贝组成 :第一类家族成员因碱基的插入和缺失改变了读码框 ,推测已失去了CHS基因的功能 ,成为假基因 ,其中个别拷贝存在较大缺失 ,这在以前的研究中未见报道 ;第二类家族成员因活性位点的氨基酸发生突变 ,可能具有新的基因功能 ;第三类家族成员则具有原CHS基因的功能。综上结果 ,可预测 ,山茶科CHS基因家族较大 ,且有着复杂的进化式样。

黑稻CHS基因外显子Ⅱ部分序列遗传变异分析

以汉中栽培2种黑稻(黑丰,黑米B)和1种白稻(香粘)为材料,根据水稻查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因DNA序列的保守区域设计3对引物,进行PCR扩增,获得CHS外显子Ⅱ部分序列,测序并与籼稻CHS基因(X 89589.1)比对,发现有13处SNP,这些SNP可能是黑稻种子黄酮类物质含量差异的重要原因之一。稻和其他植物CHS基因外显子Ⅱ序列的进化分析表明,CHS基因虽然整体上反映进化关系,但由于不同基因的进化历史不同,因此单独用CHS基因的进化树来反映物种的进化关系是不确切的,而应尽量选择多位点进行研究。研究结果为高黄酮类物质含量的黑稻育种和黑稻CHS基因在分子系统分类方面提供了必要数据。

‘变叶海棠’幼叶cDNA文库构建及CHS基因克隆

为了理解苹果类黄酮代谢的分子机制,以富含类黄酮‘变叶海棠’苹果幼叶为材料,利用SMART法构建一个苹果叶片全长cDNA文库。初级文库滴度为2.28×104 cfu/mL,库容为3.30×106个独立克隆,重组率100%,插入片段平均长度大于1.5kb。并对随机取16个重组子进行测序,经分析完整全长cDNA为7条。并从测序中获得一个查尔酮合酶(Chalcone sythase,CHS)基因,该基因cDNA全长1548bp,有一个1 170bp的开放阅读框,编码含389个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为42.44KDa,等电点5.65,该基因与已知苹果CHS基因高度同源。并构建该基因植物表达载体,用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105。

基于Chs基因序列的茎瘤芥起源进化研究

为探讨我国茎瘤芥的起源、进化,克隆、测序了30份茎瘤芥及其近缘种的Chs基因序列,并构建系统发育树、系统发育网络及网状支系结构。结果表明:系统发育树将茎瘤芥及其近缘种Chs基因序列分成3个亚支,9个支系。系统发育网络分析结果表明,茎瘤芥与其他芥菜变种之间不仅存在树状的进化关系,还大量存在非树状的进化史。网状支系分析结果表明,伊犁野生油菜可能是茎瘤芥A基因组的供体,黑芥可能是茎瘤芥B基因组的供体。茎瘤芥为芸薹属芥菜种的一个变种,与薹芥的亲缘关系较近,可能是由薹芥进化而来。单拷贝的Chs基因可作为一个理想的候选基因用于茎瘤芥及其近缘植物多倍体系统发育关系的研究。

白三叶化感作用相关基因CHS的克隆及生物信息学分析

白三叶(Trifolum repens)化感物质中含有多种化学成份,主要含有酚类与萜类及黄酮类物质,而查尔酮合成酶(CHS)是类黄酮途径的第一限速步骤,对于黄酮类物质的合成至关重要。本试验从白三叶中克隆了CHS基因cDNA序列,并对白三叶CHS基因进行了生物信息学分析。结果表明克隆到的CHS基因全长cDNA序列1473bp,其中包含了1170bp的开放阅读框(ORF),起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,103bp的5′UTR和200bp 3′UTR编码389氨基酸。且白三叶的CHS基因与同属于豆科的苜蓿CHS、大豆CHS、鹰嘴豆CHS和豌豆CHS亲缘关系最近,处于同一分支,这与植物分类相一致。

AtNCED3及AtAAO3基因启动子功能分析及其驱动CHS基因表达

NCED3及AAO3系ABA信号积累的关键基因,其转录调控研究是细胞ABA信号精细调节及植物抗逆分子机制阐明的关键.通过NCED3及AAO3启动子结构与功能的分析,建立了NCED3及AAO3启动子驱动CHS基因表达受干旱诱导致烟草花色变化的体系.

基于查尔酮合成酶(Chs)基因的玉米地方品种遗传差异分析

以16个玉米地方品种为材料,通过克隆和测序查尔酮合成酶(Chs)基因,分析玉米地方品种间的遗传差异。序列比对结果表明,(Chs)基因序列长度大约为1 240bp,16个序列存在15个变异区域,序列一致性为94.35%;品种间遗传相关性分析表明,玉米地方品种间存在遗传差异,品种间遗传相似程度高,聚类分析将16个地方品种划分成4类。此外,(Chs)基因可作为玉米系统进化分析的候选基因。

茶树CHS基因结构及编码区单核苷酸多态性分析

【目的】通过试验获得茶树CHS基因(CsCHS)gDNA序列,以进一步确定CsCHS基因结构;研究CsCHS编码区单核苷酸多态性,并结合茶树多酚含量进行关联分析,寻找基因中可能存在的与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【方法】根据NCBI数据库中已有CsCHS序列设计特异性引物,再分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增,经克隆、测序获得CsCHS1、CsCHS2、CsCHS3三个基因的gDNA和cDNA全长序列,通过序列比对方法确定CsCHS结构。利用Compute pI/Mw、SOPMA等软件对所得序列进行生物信息学分析,预测和比较CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构。以茶多酚含量差异较大的57份茶树品种为材料,分别以57份材料的cDNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,然后利用PCR产物直接测序法筛查CsCHS编码区序列的单核苷酸多态性。结合CsCHS编码区序列单核苷酸多态性和57份材料多酚含量,利用软件TASSEL进行关联分析,筛选基因中可能与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【结果】试验获得CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的cDNA序列长度分别为1 277、1 320和1 242 bp,各自均包含一个长度为1 170 bp的开放阅读框;CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的gDNA序列长度分别为1 600、1 330和1 607 bp。通过gDNA序列和cDAN序列比对,结合真核生物内含子GT-AG法则,确定CsCHS1、CsCHS3分别包含2个外显子和1个内含子,内含子大小分别为323和356 bp,CsCHS2可能没有内含子。根据CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3 cDNA序列推导三者对应氨基酸序列,比较三条氨基酸序列发现三者氨基酸同源性较高,达到92.6%—95.4%,CHS蛋白亚家族中的特征性保守位点在这三条序列中都能找到,生物信息学分析结果显示CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构高度相似。CsCHS1编码区序列中共发现71个SNP位点,SNP出现频率为1SNP/16.48 bp,无Indel,基因核苷酸多样性(π)值为0.01088;CsCHS2编码区序列中共发现55个SNP位点,SNP出现频率分别为1SNP/21.27 bp,CsCHS2核苷酸多样性(π)值(0.00530)明显低于CsCHS1;因扩增CsCHS3 cDNA序列的PCR反应成功率低,未对该基因遗传多样性进行分析。通过关联分析分别从CsCHS1和CsCHS2中找到2个和4个与茶叶多酚含量相关的SNP位点。【结论】CsCHS1和CsCHS3属于保守型CHS基因,且CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3蛋白质结构高度相似,推测三者可能在茶树的不同部位或不同生长阶段发挥类似作用;CsCHS1和CsCHS2活跃,二者编码区内可能存在突变热点区。

申克孢子丝菌chs1基因生物信息分析

目的:对申克孢子丝菌几丁质合成酶基因(chs1)及其编码蛋白的结构和特性进行分析和预测。方法:利用NCBI网站、Ex PASy和CBS等工具预测申克孢子丝菌chs1基因及编码蛋白的结构和功能。结果:chs1 mRNA全长2 745 bp,编码914个氨基酸。BLAST分析显示,申克孢子丝菌与巴西孢子丝菌、蓝菌属真菌、足马杜拉分枝菌等真菌chs氨基酸序列一致性达到99%,且有保守域。预测chs1蛋白相对分子量为102 714.7,理论等电点为6.71。预测chs1编码蛋白ɑ螺旋、β折叠、β转角、无规则卷的比例分别是38.40%、17.94%、10.39%、33.26%。chs1蛋白是一种疏水蛋白,包含9个跨膜区,未发现信号肽。结论:成功预测了chs1基因及编码蛋白质的生化性质及结构特征,为下一步对其进行克隆、表达和敲除奠定基础。

红仁核桃自然杂交后代不同表型叶片差异表达CHS基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】查尔酮合成酶(CHS)是植物黄酮类化合物合成途径中的第一个关键酶,探究关键CHS基因在红仁核桃花青苷生物合成过程中的功能,为探明红仁核桃花青苷合成的分子机制提供理论基础。【方法】以红仁核桃自然杂交后代不同表型(红叶和绿叶)株系3个发育时期的叶片为试材,观察颜色表型变化并测定其花青素含量,进一步通过转录组测序结果构建核桃CHSs基因表达图谱,筛选获得4个显著差异表达的JrCHS基因JrCHS1~JrCHS4,并利用生物信息学方法对相关序列、理化性质及结构功能进行预测分析。【结果】两种叶片在不同发育时期的颜色表型及花青素含量均存在显著差异;4个JrCHS基因在不同表型叶片的各发育时期均有表达,且均在时期1红叶中的表达量显著高于绿叶,与颜色表型变化及花青素含量呈正相关。生物信息分析表明,4个JrCHS基因分别位于不同染色体上,均只含有1个内含子结构,分布差异较小;各基因编码蛋白主要分布于细胞质中,蛋白保守结构域数量及位置、CHS功能结构域数量均相同,属于亲水酸性蛋白质,不存在跨膜结构;二级、三级结构预测显示该蛋白以α螺旋为主;通过与其他物种花青苷合成相关CHS蛋白进化分析发现,JrCHS1和JrCHS2与金花茶CnCHS、杜鹃花RsCHS及蓝莓VaCHS亲缘关系较近,JrCHS3与毛果杨PtCHS、荔枝LcCHS以及龙眼DlCHS亲缘关系较近,JrCHS4与木薯MeCHS及石榴PgCHS1、PgCHS2亲缘关系较近,表明其功能也较为相似;分析启动子顺式作用元件发现,4个JrCHS基因启动子序列中均包含多个MYB、MYC转录因子结合位点。【结论】4个JrCHS基因及其编码蛋白的结构与功能等较为相似,可能为红仁核桃自然杂交后代不同表型叶片花青苷代谢相关差异表达基因。

CHS基因起源初探及其在被子植物中的进化分析

利用PCR与TAIL—PCR方法，从半月苔(Lunularia cruciata(L.)Dum．ex Lindb．)中获得了一段长约1000bp的基因片段，它与已知的CHS基因在核苷酸水平上的相似性大于56％，在氨基酸水平上的相似性大于60％，所推断的氨基酸序列中酶反应的4个催化位点与已知晶体结构的紫花苜蓿MCHS2A上的催化位点相同，首次证明了苔类植物中可能存在类(7HS基因，将CHS基因的起源时间推到苔藓类植物出现之前。以该序列和两种蕨类植物(Psilotum nudum(L．) Griseb．和Equisetum arvense L．)的CHS序列作为外类群，应用邻接法、最大简约法和最大似然法分别构建了被子植物的CHS的分子系统树。结果表明，大部分科中的CHS分布在不同的分支上，而十字花科、豆科和禾本科各自聚成一个单系类群。以邻接树为依据，对茄科、旋花科和菊科的CHS基因进行了相对碱基替换速率的检测，发现这三个科内或科间序列的替换速率不一致。被子植物的CHS基因在基因拷贝数目、碱基替换速率以及重复／丢失事件的发生上都存在较大的差异，这种差异可能与被子植物的生活史、生活环境、花的特性以及对外界的防御系统等的多样性相关。

笃斯越橘花青苷途径中CHS基因的克隆与序列分析

以笃斯越橘花朵为试材,根据兔眼蓝莓查尔酮合成酶(VaCHS)mRNA全长序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增出长度大约为1 400bp目的片段,经测序,结果表明,笃斯越橘CHS基因(VuCHS)cDNA序列全长1 391bp,包含1 170bp开放阅读框(ORF),编码389个氨基酸,将笃斯越橘CHS基因(VuCHS)编码的蛋白质与其他来源的查尔酮合成酶蛋白的氨基酸序列进行比对,发现与兔眼蓝莓、杜鹃花和猕猴桃的一致性分别为99%、93%和93%,该基因蛋白质的氨基酸序列与其他植物CHS基因蛋白质的氨基酸序列进化分析表明,与兔眼蓝莓和猕猴桃属于同一分支,与兔眼蓝莓亲缘关系最近。

辣椒CHS基因表达的定量分析及与雄性不育的相关性

为了揭示辣椒胞质雄性不育(CMS)机制,以辣椒胞质雄性不育系9704A和其相应保持系9704B为材料,对其花蕾转录组进行了Solexa测序,经过生物信息学分析鉴别出1个花药特异性表达的查尔酮合酶基因(CHS),该基因在保持系9704B中的表达水平为其对应不育系9704A的16倍;克隆后的序列比对分析表明,该基因属于CHS基因家族,与菸草花药特异表达的同源基因CHSLK的同源性达90%;用实时荧光定量RT-PCR对9704A和9704B的根、茎、叶中CHS基因的表达进行了定量分析,结果表明该基因在2种材料的茎中几乎不表达,在9704B的根和叶中表达量也极低,证实了在正常情况下该基因只在辣椒花药中有较高水平的表达;对不育系的定量PCR结果表明,CHS基因在9704A的根和叶中有异常的较高水平表达,结合其在花药中的低表达,推测辣椒不育系中CHS的异常表达可能与其CMS性状相关。

用SON-PCR快速获得长鞭红景天CHS基因全长及其序列分析

采用单侧寡聚核苷酸嵌套PCR(SON-PCR)方法,从长鞭红景天中扩增得到查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS),命名为Rhchs,其序列全长为2 443 bp,包括682 bp的启动子区、957 bp的开放阅读框和3′UTR区。预测序列编码381个氨基酸,其氨基酸组成与其他已知的高等植物的查尔酮合成酶具有很高的同源性,与葡萄、山茶花、杜鹃和牵牛的同源性分别为87%、87%、86%和85%。且大部分氨基酸序列保守。序列分析表明,在启动子区域也找到了TATA-box、W-box、G-box like等顺式作用元件。

谷子CHs家族全基因组鉴定及表达分析

查尔酮合酶(CHs)是植物类黄酮途径的关键酶,在植物生长发育及响应生物与非生物胁迫等方面有重要作用。利用生物信息学方法筛选了Xiaomi中CHs基因家族成员,并对其系统进化、理化性质、蛋白结构、启动子顺式作用元件及表达情况进行分析。结果表明,共鉴定到同时含有Chal_sti_synt_C和Chal_sti_synt_N保守域的谷子CHs基因33个,分布于1、2、4、5、7、8、9号染色体,其中在8号染色体上分布最多为11个,编码氨基酸平均数目423个,蛋白分子质量为16.74~57.50 ku;系统发育分析表明,CHs家族基因同源性较高,且该家族成员含有响应水杨酸和生长素等激素的顺式作用元件及调控类黄酮生物合成相关基因,不同基因在种子、根、茎、叶和穗之间存在组织特异性表达,其中SiCHs2、SiCHs27和SiCHs32基因在茎部表达量高,SiCHs18基因在根部表达量高;转录表达分析表明,受禾生指梗霉菌胁迫,22个SiCHs基因表达显著上调,类黄酮、花青素等物质合成及水杨酸、生长素等激素合成途径显著富集。综上可见,SiCHs2、SiCHs27和SiCHs32基因可能参与茎部生长调控,SiCHs18基因可能参与根部生长调控,CHs家族基因可通过合成抗病类次生代谢产物及调控激素来响应病原菌侵染。

胭脂萝卜RsCHS1基因克隆及表达分析

为解析RsCHS1基因在胭脂萝卜色素积累中的作用,以胭脂萝卜肉质根肉质cDNA为模板,同源克隆了RsCHS1基因的开放阅读框(ORF),采用生物信息学方法对RsCHS1蛋白的理化性质进行分析。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了RsCHS1基因在胭脂萝卜营养期叶、肉质根肉质和肉质根皮及花期花、荚果和肉质根肉质中的表达情况,同时构建RsCHS1基因过表达载体,异源转化拟南芥,进行RsCHS1基因功能验证。结果表明,克隆得到2个RsCHS1基因,其中RsCHS1-a基因ORF序列长765 bp,编码254个氨基酸;RsCHS1-b基因ORF序列长966 bp,编码321个氨基酸。编码蛋白二、三级结构预测显示,α-螺旋是RsCHS1主要结构元件,β-转角、片层结构、无规则卷曲分布于整个蛋白质中。qRTPCR结果表明,RsCHS1-a基因在肉质根肉质(26.8)、根皮(32.4)和花(6.7)中的相对表达量比叶(1.0)和果实(0.4)中高,RsCHS1-b基因在肉质根肉质(41.4)、根皮(41.9)和花(9.7)中的相对表达量比叶(1.0)和果实(0.6)中高,说明RsCHS1基因具有组织表达特异性。在拟南芥中过表达RsCHS1基因,发现转基因植株叶柄和茎累积大量花青素,表明RsCHS1基因在胭脂萝卜花青素积累中起到重要作用。

转CHS基因非洲菊的组培快繁

以转CHS基因非洲菊株系的茎尖、茎段和叶柄为外植体,分别比较了3种外植体形成愈伤组织的能力,并对茎尖诱导培养基、增殖培养基、生根培养基以及无土基质进行初步筛选,结果表明:形成愈伤组织能力以茎尖最好,茎段次之,叶柄最差;茎尖最佳诱导培养基为MS+BA1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L,增殖培养基为MS+BA 2.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L或MS+Kt 3.0mg/L+IAA 0.05mg/L,生根培养基为MS+NAA 0.3 mg/L+IBA 0.3 mg/L,无土基质及配比为珍珠岩∶腐熟谷壳=1∶2。