Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路抑制大鼠牙髓干细胞成骨诱导分化的机制

目的探讨Chir99021对大鼠牙髓干细胞(DPSCs)成骨诱导分化的影响及机制。方法原代分离大鼠DPSCs,利用荧光免疫法进行验证。设置不同浓度的Chir99021,通过CCK-8检测细胞增殖情况挑选最适浓度。利用茜素红染色验证细胞成骨诱导分化。最后通过Real-time PCR、Western blotting检测成骨诱导分化相关基因与蛋白无翅型MMTV整合位点家族成员1(Wnt1)、无翅型MMTV整合位点家族成员3A(Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)、轴抑制蛋白2抗体(Axin2)、骨钙素(OCN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的mRNA和蛋白表达情况。结果牙本质涎磷蛋白(DSPP)和干细胞标记物波形蛋白(vimentin)阳性表达,说明大鼠DPSCs分离成功。大鼠DPSCs成骨诱导后钙沉积物显著上升,加入糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的小分子抑制剂Chir99021后钙沉积物明显减少。大鼠DPSCs成骨诱导分化后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1表达明显上升,而加入Chir99021后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1蛋白表达均显著下降。结论Chir99021对诱导7 d后的大鼠DPSCs成骨诱导分化有一定的抑制作用。

Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预干细胞成骨/成牙分化的研究

目的:探讨Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路干预人牙髓干细胞成骨/成牙分化及其可能的机制。方法:分离纯化和培养人前磨牙牙髓干细胞(HDPSCs),免疫荧光检测牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和波形蛋白(Vimentin),CCK-8检测不同浓度Chir99021对HDPSCs细胞增殖作用的影响。将HDPSCs分为3组培养,第1组正常培养,为空白对照组;第2组成骨诱导液培养,为实验对照组;第3组成骨诱导液+Chir99021培养,为实验组。15 d后用茜素红染色对各组细胞进行钙沉积物检测;qPCR于5、10、15 d检测各组轴抑制蛋白2(axisinhibition protein2,Axin2)、β连环蛋白(β-catenin)及糖原合成激酶3(GSK-3β)水平;Western blot于5、10、15 d检测各组RUNT相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和Ⅰ型胶原的表达。结果:分离培养后的HDPSCs中DSP和Vimentin呈阳性表达;Chir99021浓度为2000 nmol/L时,细胞增殖情况最明显;茜红素染色显示实验组钙沉积物较其余两组显著增加;实验组中Axin2、β-catenin显著上升,GSK-3β显著下降(P<0.05);Runx2、ALP在实验组及实验对照组中有显著表达(P<0.05),OC在实验组中显著表达(P<0.05);DSPP、Ⅰ型胶原在实验组中显著表达(P<0.05)。结论:Chir99021通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进HDPSCs的增殖和成骨/成牙分化。

CHIR99021对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的双重作用

目的研究CHIR99021在小鼠胚胎干细胞（m ESCs）分化为心肌细胞的作用。方法运用经典的悬滴培养法促进m ESCs形成拟胚体（EBs）。在不同分化时间段加入糖原合成激酶-3β（GSK-3β）抑制剂CHIR99021,诱导m ESCs向心肌细胞分化,相差显微镜在不同时间点观察不同组EBs搏动百分率。RT-PCR法检测心肌特异性转录因子Nkχ2.5、α-肌球蛋白重链（α-MHC）基因表达水平的变化。Western blot法和免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白c Tn T的表达。实验时将不加入CHIR99021命名为对照组,分化第2~5天和第6~10天加入CHIR99021分别命名为2~5 d组和6~10 d组。结果通过悬滴培养法能够形成EBs,且形成的EBs能够出现自发性搏动并有c Tn T表达。在诱导分化的过程中,第2~5天加入CHIR99021的2~5 d组的搏动EBs百分率比对照组更高,Nkχ2.5、α-MHC基因表达的水平也比对照组高;6~10 d组的结果跟2~5 d组相反。各组中都可通过Western blot和免疫荧光染色法检测到c Tn T的表达,但2~5d组的c Tn T的表达量高于对照组,6~10 d组的c Tn T的表达量低于对照组。结论GSK-3β抑制剂CHIR99021对m ESCs心肌细胞分化具有双重作用,即分化前期（2~5 d）促进分化,可获得更高的分化率,分化后期（6~10 d）结果相反。

CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

目的观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞(m ESCs)向心肌细胞分化中的作用。方法采用悬浮一步培养法形成拟胚体(EBs),在EBs形成后第2天至第5天分别加入CHIR99021、Wnt3a,命名为CHIR99021组及Wnt3a组,将自动分化的EBs作为对照组。用免疫荧光法检测心肌特异性蛋白肌球蛋白重链(α-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)及膜联蛋白43(CX43)的表达。用qRT-PCR检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达。用Western blot法检测α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达。结果免疫荧光法提示各组m ESCs能够向心肌细胞分化。在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中,Brachyury在分化第7天达高峰;Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的mRNA表达量随着分化时间的延长而逐渐增加,第15天增加最为明显,且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组;CHIR99021组优于Wnt3a组(P<0.05,P<0.01)。Western blot检测结果显示CHIR99021组和Wnt3a组α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达量明显高于对照组,CHIR99021组高于Wnt3a组。结论 CHIR99021和Wnt3a在分化早期阶段通过活化Wnt/β-catenin信号通路可促进m ESCs心肌细胞分化,且CHIR99021促心肌分化作用优于Wnt3a。

Chir99021联合PD0325901对小鼠胚胎干细胞中miRNAs差异表达的影响

目的通过研究Chir99021联合PD0325901对小鼠胚胎干细胞中mi RNAs差异表达的影响,为揭示胚胎干细胞的自我更新和分化的机制提供更多线索。方法采用mi RNA基因芯片技术检测Chir99021联合PD0325901处理组和PD0325901处理组mi RNAs的表达谱差异。选取3倍以上及通过查文献与胚胎干细胞自我更新相关的1.5倍以上3倍以下的mi RNAs,采用实时荧光定量PCR法验证,利用mi RDB、Miranda两个数据库交叉预测差异表达的靶基因,并应用KEGG Pathway进行靶基因功能富集分析。结果与PD0325901单独处理相比,Chir99021联合PD0325901处理组有47种mi RNAs上调1.5倍以上,75种mi RNAs下调1.5倍以上;用实时荧光定量PCR验证差异表达的mi RNAs,结果显示13个mi RNAs与芯片结果相符。靶基因预测分析显示,mi R-466a-5p、mi R-466d-5p处于重要位置,Plcb1、Prkcb处于关键基因位置。结论 Chir99021可引起小鼠胚胎干细胞中的mi RNAs差异表达,差异表达的mi RNAs可能通过调控Plcb1、Prkcb基因而影响胚胎干细胞的自我更新。

糖原合成酶激酶3β抑制剂CHIR99021诱导人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞

目的探讨糖原合成酶激酶(GSK)3β抑制剂CHIR99021诱导人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞的可行性。方法将人胚胎干细胞H1细胞置于无滋养层培养基(Essential 8)培养。采用免疫荧光法检测人胚胎干细胞多能性标志物Oct4、Nanog的表达。于细胞中加入0.33、1.00、3.00、9.00、27.00μmol/L浓度的CHIR99021培养3 d,以不加CHIR99021的细胞作对照。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞多能性相关基因OCT4、SOX2和限定性内胚层相关基因GATA4、SOX17的表达水平。实验数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果免疫荧光法能够检测到人胚胎干细胞多能性标志物Oct4、Nanog的表达。经0.33、1.00、3.00μmol/L CHIR99021处理后的人胚胎干细胞生长状态良好,CHIR99021浓度较高时细胞生长状态较差或死亡。经1.00、3.00μmol/L CHIR99021处理后的细胞多能性相关基因OCT4表达均下调(LSD-t=-40.54,-59.12;P<0.05),SOX2表达亦明显下调(LSD-t=-20.46,-3.87;P<0.05)。经1.00、3.00μmol/L CHIR99021处理后的细胞限定性内胚层相关基因GATA4表达上调(LSD-t=137.21,65.29;P<0.05),SOX17表达亦明显上调(LSD-t=50.93,6.56;P<0.05)。结论人胚胎干细胞应用无滋养层培养仍然保持良好的干细胞生物学特性。CHIR99021可以高效诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化。

添加小分子化合物CHIR99021维持水牛精原细胞的体外培养

目前,水牛精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)体外培养系统因尚无法支持水牛(Bubalus bubalis)SSCs体外长久培养而限制了水牛雄性遗传资源的高效利用。通过添加合适小分子化合物优化水牛SSCs体外培养系统是一个可选方案。本研究推测GSK3β特异性抑制剂CHIR99021能促进水牛精原细胞的体外增殖和自我更新。为了验证此假说,本研究探索了添加不同浓度CHIR99021对水牛精原细胞体外培养效果的影响。分别将不同浓度CHIR99021(0,5,10,20μmol/L)添加到水牛精原细胞体外培养细胞培养液中,设置4个试验组,体外培养7 d后收集细胞,进行实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光染色细胞计数。RT-qPCR结果表明,添加10、20μmol/L的CHIR99021显著提高了SSCs特异性表达基因(PLZF,Nanos2)和增殖相关基因(CCND1,CCNE1)的表达水平;显著降低了分化相关基因(DMRT1,DAZL)和氧化相关基因(CAT,SOD3)的表达水平。通过免疫荧光染色进行DDX4^(+)和PGP9.5^(+)细胞计数,发现添加10μmol/L CHIR99021显著增加了精原细胞数量。以上结果说明,在体外培养系统中添加CHIR99021能有效维持水牛精原细胞的SSCs分子特征,促进其体外增殖,显著改善了水牛精原细胞体外培养条件。本研究能为利用小分子化合物优化水牛SSCs体外培养系统提供重要参考。

增强定向造血分化信号提高人胚胎干细胞向自然杀伤细胞生成的效率

目的探讨在造血分化阶段增强定向造血(DH)信号对人胚胎干细胞(hESCs)分化形成的自然杀伤(NK)细胞(也称为hESC-NK细胞)生成效率和功能的影响。方法hESC(H1)经离心法形成拟胚体,在诱导造血分化的第0至8天,对照组加入BMP4、VEGF、bFGF、SCF等细胞因子;而增强定向造血(DH)组在对照组的基础上添加WNT激动剂(CHIR99021)和Nodal-activin抑制剂(SB431542);进而采用一致的方法分化形成NK细胞。使用流式细胞术和靶细胞K562共培养等方法分析造血分化效率、NK细胞生成效率、体外效应功能及表面受体等相关分子表达。结果相较于对照组,DH组在造血分化阶段第8天动脉生血内皮细胞(CD34^(+)DLL4^(+))数量显著增加,原始造血相关细胞(CD34^(-)CD43^(+))显著降低(P<0.05)。在NK细胞分化第28天分析发现,DH组NK细胞(CD45^(+)CD56^(+))数量显著增加,效应功能相关分子IFN-γ、Granzyme B、Perforin、CD107a虽微弱上升,但无统计学差异,激活性受体CD16a和CD69明显增加,但NKP46显著降低,抑制性受体NKG2A显著增加,CD96显著降低(P<0.05)。结论在hESC向造血分化过程中增强定向造血信号,在不影响NK细胞体外功能的情况下显著提高NK细胞生成效率和CD16a表达,为提高hESC-NK细胞或iPSC-NK细胞生成效率提供了一种新的思路。

三种小分子化合物对猪胎儿成纤维细胞DNA精确修复效率的影响

旨在研究3种小分子化合物(RS-1、Chir99021和PD173074)对猪胎儿成纤维细胞DNA精确修复效率的影响。本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)为试验对象,利用HDR通路关键因子Rad51激活剂RS-1、Wnt信号通路关键因子糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)抑制剂Chir99021和成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR1)抑制剂PD173074培养细胞,通过流式细胞术检测绿色荧光细胞数百分比来验证3种小分子化合物对DNA精确修复效率的影响。结果显示:1)经不同剂量的Chir99021和PD173074处理后,PFFs DNA损伤修复因子LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6和Rad51表达水平都显著下调(P <0. 05),而经不同浓度PD173074(0. 1～0. 5μmol·L^(-1))处理后,PNKP因子表达上调(P <0. 05)。2) Chir99021低剂量时可显著提高同源重组修复(homologous recombination,HR)介导的同源重组效率,Chir99021高剂量时可显著提高单链退火修复(single strand annealing,SSA)介导的同源重组效率; RS-1和PD173074低剂量时可显著提高HR效率(P <0. 05),但RS-1在高浓度时显著下调SSA修复效率(P <0. 05),而PD173074对SSA效率无显著影响(P>0. 05);此外单链寡核苷酸介导的DNA修复(single-stranded oligonucleotide,ss ODN)效率并不受小分子化合物处理的影响(P>0. 05)。本研究结果表明,适当浓度小分子化合物的应用有利于不同策略的基因敲入细胞系的产生,为获得精确的遗传修饰的动物模型打基础。

糖原合成激酶抑制剂在胚胎干细胞自我更新中的作用

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)是从早期囊胚内细胞团分离培养出来的能够不断维持自我更新和具有发育多能性的细胞。Wnt信号通路在维持胚胎干细胞的自我更新方面起着重要作用,糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)抑制剂可以激活Wnt信号通路,促进胚胎干细胞自我更新和增强细胞间连接。作者就GSK-3抑制剂在胚胎干细胞自我更新、细胞连接方面的作用及其作用机制进行简单综述。

非贴壁微球体培养法分离T-淋巴细胞瘤干细胞及鉴定

通过非贴壁微球体无血清培养法,体外构建并鉴定了T-淋巴细胞瘤干细胞。采用细胞球悬浮培养方法富集T-淋巴细胞肿瘤干细胞,利用抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074(2i)进行肿瘤干细胞的筛选,采用RT-PCR法检测Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc干细胞特征基因的表达,进一步采用Western blot验证Oct4蛋白水平表达,流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达情况,用PI检测细胞周期,用CFSE观察细胞增殖能力,并将富集的T-淋巴细胞肿瘤干细胞进行裸鼠异体移植实验。在细胞球悬浮培养法基础上,利用具有抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074,成功富集出Hut-102干细胞球。经RT-PCR鉴定,Hut-102干细胞球的其干细胞特征基因Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc表达均显著性高于Hut-102细胞并且高表达Oct4蛋白;经流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达,有74.20%的Hut-102干细胞球表现为CD34+,有90.82%的Hut-102干细胞球表现为CD44+,证明抑制分化药物应用于细胞球悬浮培养方法中,能够有效富集出具有CD34+CD44+表型特征的Hut-102干细胞球;用PI检测细胞周期,富集的Hut-102干细胞球中处于G1/G0期的细胞为64%,处于S期的细胞为30.56%,表明该细胞暂不增殖或处于休止状态;用CFSE检测到富集的Hut-102干细胞球分化增殖能力显著高于Hut-102细胞。在NON/SCID裸鼠中,分别移植Hut-102细胞球和Hut-102细胞,结果显示,前者检测到67.74%±5.32%的淋巴细胞表达Hut-102细胞特异性标记物(CD3),而后者的裸鼠中未检测到,说明Hut102细胞球在NON/SCID裸鼠体内表现了T-淋巴细胞肿瘤干细胞特点和移植能力。首次在传统的非黏连微球体无血清培养法中加入两种抑制剂(CHIR99021和PD173074),富集出大量的微球体,通过干细胞特征鉴定及裸鼠移植实验,证明Hut-102细胞球具有T-淋巴细胞肿瘤干细胞特性。