不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响

目的:比较野生型和突变型(58 bp缺失)DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响.方法:将表达人野生型和缺失型DNA polβ的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),用RT-PCR方法鉴定野生型和缺失型DNA polβmRNA水平的表达,MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期.结果:转染野生型和突变型DNA polβ的CHO细胞株中,都有外源基因mRNA水平的表达;转染突变型(58 bp缺失)polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞,差异有统计学意义(P<0.05).而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响(P>0.05).结论:高表达外源性野生型和突变型DNA polβ,对CHO细胞生长具有不同的影响.

检测CHO基因工程乙肝疫苗残余DNA方法的建立和应用

对样品的处理方法进行了探索，最后选用一个疫苗剂量的蛋白酶Ｋ同时消化样品和标准ＤＮＡ，并将消化处理后的样品和标准ＤＮＡ用地高辛标记的探针进行检测，灵敏度达１０ｐｇ。共检测２１批检品，除一批ＤＮＡ残余量超过１００ｐｇ／ｄｏｓｅ以外，其它２０批样品的ＤＮＡ残余量均低于１００ｐｇ／ｄｏｓｅ。

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达(英文)

目的 观察编码旋毛虫相对分子质量 (Mr) 3 10 0 0抗原的DNA疫苗 (重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。 方法 通过用阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞 ,G418筛选阳性克隆 ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、间接荧光抗体试验 (I FAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)对表达产物进行鉴定。 结果 RT PCR结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在 876bp处有一条带 ,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带 ,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约 3 10 0 0的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。 结论 重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞 ,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达 ,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫?

磁珠分离结合定量PCR法检测单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量

目的 利用磁珠分离法结合定量PCR技术，建立单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法，并进行验证及初步应用。方法通过磁珠分离法提取样品中的残留DNA，再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定，根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行种属特异性、准确性及精密性验证，并对5个厂家15批单克隆抗体类产品中的残留DNA进行测定。结果该方法检测CHO细胞DNA残留的最低准确定量浓度可达1×10^-3pg／μl，DNA含量在1×10^-3～10^2 pg／μl范围内曲线线性良好，标准曲线的相关系数为0.994；该方法能特异性地检测CHO细胞DNA，对其他种属的DNA无扩增反应；该方法检测不同DNA加标量样品的DNA回收率相近，均值均在90％以上，3次测定的相对标准偏差均小于20％，92.6％加标样品的DNA回收率在70％～130％之间；该方法检测15批单克隆抗体类产品的DNA残留量均小于100pg／剂量，符合《中国药典》三部（2010版）有关CHO细胞残余DNA的要求。结论磁珠分离法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点，定量PCR法能够简便、快速、准确地对不同工艺的单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留进行定量测定。

CHO宿主细胞DNA残留量检测方法的建立

目的建立检测生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的方法,制备检测CHO细胞DNA残留量的内部参考品,为国家相关标准的制定和修订提供依据。方法分别采用酚:氯仿:异戊醇抽提、DNA提取试剂盒和高盐抽提3种方法提取CHO细胞DNA,比较3种方法的提取效果;用地高辛标记最佳方法提取的CHO细胞DNA探针,并优化标记体系,直接法检测探针的标记效率;采用3种方法处理CHO细胞DNA内部参考品(1组不作处理;2组加入牛血清白蛋白和蛋白酶K;3组按2组方法处理后,增加DNA抽提步骤),通过点杂交法,用标记的探针检测上述样品的灵敏度。结果高盐抽提法提取的CHO细胞DNA效果较好;体系4(DNA10μg,Vial416μl,总体积64μl)标记效率最高;经不同方法处理的1、2、3组CHO细胞DNA内部参考品的检测灵敏度分别为1pg、10pg和1ng。结论建立的地高辛标记CHO细胞DNA探针-点杂交检测CHO细胞DNA残留量的方法稳定可靠,可用于生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的检测。

CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(PCR-Taqman探针法)的方法学验证

目的:中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)宿主细胞DNA残留检测(PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法:利用磁珠分离法结合Taqman探针定量PCR技术,对自主研制的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限、参考品DNA标定等验证。特别针对残留定量限、蛋白浓度、pH值、缓冲体系等关键影响因素,以及生产工艺各中间品进行回收率考察,验证试剂盒对复杂样品的检测性能。选取采用不同工艺的多个重组蛋白产品,通过独立三方协作标定,开展试剂盒的适用性研究。结果:DNA标准曲线在3 fg·μL-1～300 pg·μL-1范围内,线性良好(R2> 0. 99);对5个浓度梯度检测的准确度偏差均<10%;定量限为0. 5 fg·μL-1;内部参考品DNA标定结果为10μg·m L-1;精密度良好(RSD≤15%);大鼠、小鼠、大肠杆菌、人类基因组DNA对检测无干扰。另外,对于样品中DNA含量在1pg·m L-1～10 ng·m L-1、pH值在4～9,采用磷酸缓冲体系、Tris缓冲体系、醋酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系等多种基质样品,以及生产工艺中间品的检测回收率均在70%～130%,RSD均<15%。3个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论:自主研发CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(荧光探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足复杂基质条件下各种重组制品的宿主DNA残留检测要求。

基因工程乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)连续纯化流程的建立

研究了高效表达HBsAg的CHO-B43细胞系经转瓶培养所获液体的纯化流程,具体步骤是:细胞培养液经7 500r/min 4℃离心30分钟,除去脱落细胞及碎片,加固体硫酸铵达50％饱和度进行沉淀,离心后弃上清,再用45％的饱和硫酸铵重新悬浮,离心,保留沉淀物;正压超滤透析后,分别选用1.24g/cm^3和1.20g/cm^3的KBr浮力密度,相继进行两次32 000r/min 17℃ 46小时的平衡密度超速离心,收集HBsAg活性部分,过Sepharose 4B分子筛层析柱,再收集HBsAg活性峰,进行最后一次1.22g/cm^2 CsC1平衡密度梯度超速离心。由此流程HBsAg最终回收率为50％～65％,所获纯品纯度达95％以上,经电镜检查,牛血清残余量(<8.430ng/Dose)和细胞DNA残余量(<32pg/Dose),均符合WHO规定的基因工程HBsAg人体接种的标准。

重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用。方法采用磁珠分离法提取样品中残留的CHO细胞DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行Q-PCR检测,根据标准曲线进行DNA残留量分析。对建立的方法进行专属性、准确性、重复性及中间精密度验证,并对重组人凝血因子Ⅷ原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果该方法 DNA浓度在0.003~300 pg/μL范围内,线性关系良好,R2为0.999,灵敏度可达0.003 pg/μL;对大肠埃希菌DNA无特异性扩增曲线,专属性良好;检测高、中、低浓度DNA加标量样品的回收率分别为82.68%、71.75%和72.67%,准确性良好;重复性检测的RSD为7.02%,中间精密度检测的RSD为9.31%,重复性及精密度良好。用该方法检测的3批重组人凝血因子Ⅷ原液的DNA残留量均远低于100 pg/剂量。结论成功建立了特异的CHO细胞DNA残留量的检测方法,该方法专属性好,准确性及精密度高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。

FuGENE 6 Transfection Reagent及pEGFP-N1-HSF1转染JEG-3细胞条件的优化

目的:优化FuGENE~?6 Transfection Reagent(FuGENE)转染质粒pEGFP-N1-HSF1到人绒毛膜癌细胞JEG-3的条件。方法:利用DNA延滞实验考察pEGFP-N1-HSF1质粒与FuGENE试剂的结合力,用不同剂量的FuGENE试剂和质粒转染JEG-3细胞,通过倒置荧光显微镜和血球计数法计算其转染效率,筛选出最佳的转染条件并进行转染,通过qRT-PCR检测HSF1 mRNA的水平。结果:DNA延滞实验显示FuGENE和pEGFP-N1-HSF1质粒具有较高的结合力,当质粒量一定时,随着FuGENE量的增加,其转染效率先增加后降低;当FuGENE和质粒比例为2∶1(μL∶μg)时,转染效率最高,达(39.05±1.19)%;当固定转染比例时,随着转染剂量的增加,其转染效率先增加后降低,当转染剂量为250μL时,转染效率最高,达(42.98±2.56)%;qRT-PCR结果显示,转染组HSF1 mRNA的水平较对照组有显著上调。结论:在转染比例为2∶1,转染剂量为250μL时,对JEG-3细胞有最佳的转染效率。

康柏西普制品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的CHO细胞DNA残留量荧光定量PCR（Q-PCR）检测方法。方法采用DNeasy Tissue Kit提取CHO细胞基因组DNA,制备DNA标准品;确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,并验证其专属性、准确性及精密性;用建立的方法对1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果建立的标准曲线Ct值与模板DNA浓度的对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.99以上;检测HUVEC、HEK293细胞的DNA残留量均无特异性扩增曲线;检测高、中、低浓度的DNA标准品（105、103、101pg/ml）的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范围（50%~200%）内,批间变异系数分别为9.3%、21.8%、26.8%;检测100pg/ml浓度的DNA标准品的平均回收率为111.6%,变异系数为20.4%;康柏西普原液的DNA残留量远低于100 pg/剂量。结论已成功建立特异的CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,该方法专属性好,准确性及精密性高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。

长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R^2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%~101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCK细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%~2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R^2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。

中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品的研制

目的建立中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量定量测定用国家标准品。方法使用QIAGEN Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备了中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA作为标准品原料,通过紫外分光光度法和电泳进行纯度和含量测定后分装,采用紫外分光光度法对我国第一批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品进行协作标定,并评价其稳定性和适用性。结果中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品经检测,A260/A280均在1.7～1.9之间,电泳图谱只有单一条带,符合规定。该标准品经6家实验室协作标定共90次,几何平均含量为93.63μg.mL-1,平均含量的95%可信区间为92.86～94.40μg.mL-1,单次测定的95%参考值范围为86.51～100.89μg.mL-1,平均可信限率为0.81%。加速热稳定实验表明,该标准品在-20、4、25、37℃条件下放置4个月,DNA含量无明显改变,但37℃条件下A260/A280有下降趋势;-20、4、25℃条件下电泳结果为单一条带,37℃条件下DNA有降解条带。-20℃贮存1年的长期稳定性结果显示,标准品DNA浓度及A260/A280无显著性差异,电泳条带单一,因此-20℃条件下长期保存标准品稳定性较好。在标准品适用性研究中,利用该标准品进行荧光染色法测定,标准曲线r值为0.999 0以上,在0.781～100 ng.mL-1之间线性良好,各稀释度RSD均小于10%;利用该标准品进行定量PCR法测定,标准曲线r值为0.990 0以上,在10-2～103pg之间线性良好,熔解曲线可见单一峰出现。结论该批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于荧光染色法和定量PCR检测中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量,含量定为93.63μg.mL-1,批号为270026-201101。

乙脑病毒prME蛋白与BALB／c鼠IgG Fc段编码基因联合构建DNA免疫研究

目的研究IgG Fc编码基因对流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）DNA疫苗免疫增强效应的影响。方法巢式RT-PCR法从BALB／c鼠脾组织获取IgG Fc段编码基因，用限制性内切酶从含流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）prME蛋白基因重组子获取prME蛋白基因，分别插入同一真核表达载体pcDNA3．1（＋）不同酶切位点，构建重组子pJME／IgG Fc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJME／IgG Fc转染CHO细胞。免疫荧光、Western blot法检测转染的CHO细胞中融合蛋白分布与表达。将pJME／IgG Fc肌注免疫BALB／c鼠，检测小鼠脾特异性细胞毒T细胞（CTL）杀伤活性和中和抗体滴度。结果pJME／IgGFc经BamHI／EcoRI和BamHI／NotI酶切释出的插入子大小（2001 bp、2730 bp）分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白相对分子质量（Mr）为101×10^3，主要分布于胞浆，少量分布于胞膜，pJME／IgG Fc转染CHO细胞经32次传代仍可表达融合蛋白。pJME／IgG Fc免疫组中和抗体滴度与CTL活性较pJME及灭活疫苗组均升高（P〈0．05）。结论pJME／IgG Fc成功构建，转染的CHO细胞可稳定表达融合蛋白，IgG Fc段编码基因能够增强JEV DNA疫苗的细胞和体液免疫应答。

抗CD52单克隆抗体外源DNA残留量检测方法的建立及验证

目的建立检测抗CD52单克隆抗体原液中残余DNA的方法,并对该方法进行验证。方法利用CHO Host Cell DNA Extraction&Amplification Kit,采用qPCR法检测抗CD52单克隆抗体中宿主细胞残留DNA含量,并进行方法的专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果该方法可以准确定量检测CHO细胞残留DNA含量。专属性验证试验中对照制剂无特异扩增曲线,而CHO细胞上清有明显的扩增曲线;5次试验中标准曲线相关系数R^2均≥0.98,表明该方法线性良好;准确度验证试验中所有试验的加标回收率均在70%~130%范围内;精密度验证试验中所有试验检测结果的相对标准偏差(RSD)均不大于30%;耐用性验证试验中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的CV为0.85%,不同稀释倍数的供试品加标回收率在70%~130%范围内,不同稀释倍数外源DNA检测结果CV为4.71%。结论该方法专属性、准确度、精密度、线性和耐用性均符合要求,可采用该试剂盒qPCR法检测外源DNA残留量。

两种测定生物制品宿主细胞DNA残留量方法的建立

目的建立特异性强、检测限低、准确度高的生物制品中宿主细胞DNA残留量的检测方法。方法通过优化,提高磁珠分离法和化学沉淀法提取样品中残留DNA的准确度,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR(quantitative PCR,q PCR)检测,分析样品中DNA残留量。对建立的两种检测体系进行专属性、精密度、准确度、耐用性验证,并确定两种方法的检测限和定量限。结果建立的q PCR体系标准曲线的相关系数(R2)均高于0. 99,能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属DNA无扩增反应。不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在60. 0%~140. 0%,3次测定的相对标准偏差(RSD)均小于30%。不同的退火温度反应条件下,RSD不大于30%。基于磁珠分离法的qPCR检测体系能检测出DNA残留浓度为5 pg/m L的DNA样品,定量限可达10 pg/mL;基于化学沉淀法的qPCR检测体系能检测出DNA残留浓度为0. 125 pg/m L的DNA样品,定量限可达1. 5 pg/mL。结论建立并优化了两种准确测定生物制品宿主细胞DNA残留量的处理样品方法,其中化学沉淀法检测限和定量限较低,更适合低浓度生物制品的样品处理。

中国仓鼠卵巢细胞表观遗传调控研究进展

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞因其具有可悬浮培养及进行蛋白质糖基化等翻译后修饰等优势,在生物制药重组蛋白生产方面具有不可替代的重要作用。但转基因沉默、表观遗传修饰等影响基因表达调控,造成CHO细胞表达稳定性降低而导致重组蛋白产量下降。本文对CHO细胞中表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA的作用研究,以及对基因表达调控的影响进行了综述。