CHO/dhfr^-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hotspot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106cell.24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。

稳定表达细胞色素P4502B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立及鉴定

目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5/FRT-CYP2B6重组质粒转染至Flp-In^(TM)CHO空载体组细胞和Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)及荧光素酶实验检测转染细胞中CYP2B6 mRNA水平、蛋白表达水平及活性,用四氮唑盐(MTS)测定转染CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞对环磷酰胺的毒性敏感性。结果与Flp-In^(TM)CHO组和Flp-In^(TM)CHO空载体组相比,Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中CYP2B6的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)、酶活性显著增加(P<0.001),对环磷酰胺的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建稳定表达CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系,为研究药物代谢和筛选毒性药物提供工具。

恒稳磁场辅助CHO细胞培养和表达特性研究

以中国仓鼠卵巢细胞为宿主细胞构建重组表达细胞用以表达单克隆抗体,已经被广泛应用于生物制药领域。物理调控是影响细胞增殖和表达的重要方式,但针对恒稳磁场暴露下的CHO细胞培养及其抗体表达还鲜有报道。基于此,文章利用3.0 mT恒稳磁场,在37℃、8%CO_(2)环境下对CHO细胞进行克隆培养,通过克隆扩增筛选、蛋白表达及分析、拷贝数监测等手段来评估其对抗体表达的影响。结果表明,与对照组相比,在3.0 mT磁场环境下,单克隆形成数量增加了13.24%,细胞数量显著增多,单克隆抗体表达水平提升53.2%,克隆筛选周期缩短4~5 d。此外,在亚克隆筛选中,亚克隆的细胞数量和抗体表达在磁场暴露下略有增加,而抗体表达、蛋白质量和基因拷贝数在传代后均无显著变化,表明磁场暴露环境中培养的重组CHO细胞具有稳定的性质。该研究结果有望为未来CHO细胞的大规模培养以及磁场暴露下的高效生产抗体研究提供参考。

锌离子对CHO细胞IgG2抗体表达及二硫键异构体分布的影响

目的:研究Zn^(2+)对中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)生长、IgG2表达及其二硫键异构体分布的影响。方法:补料分批培养外分泌IgG2的CHO细胞株中,分别添加不同浓度的葡萄糖酸锌,每天监测细胞密度以及活率;培养14 d后离心除细胞得上清液,通过生化分析仪测定上清液中IgG2含量,之后应用蛋白A磁珠亲和得到IgG2纯化样品,非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测IgG2二硫键异构体分布。结果:25~200μmol/L浓度条件下,Zn^(2+)对于CHO细胞生长,活率维持以及IgG2抗体的表达均有一定的负面影响,并与Zn^(2+)浓度具有负相关性;而Zn^(2+)的添加能够显著提高IgG2二硫键异构体中IgG2-B亚型的比例,下调IgG2-A和IgG2-A/B两种亚型比例。其中100μmol/L Zn^(2+)效果最明显,IgG2-B比例提高近10个百分点。结论:Zn^(2+)能够抑制CHO细胞生长以及IgG2表达,同时Zn^(2+)对二硫键异构体的调控至关重要。

接种重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)偶合带状疱疹性神经痛1例

采用流行病学方法提取受种者、疫苗生产企业和接种方相关资料,对接种重组带状疱疹(HZ)疫苗(CHO细胞)后出现的1例HZ性神经痛(PHN)病例开展调查,评估PHN与疫苗接种的因果关系,并为防止类似事件提供科学依据。根据疫苗接种与临床表现的时间和因果关联等确定所患PHN与疫苗无因果关系,不属于预防接种异常反应,属偶合症。重组HZ疫苗是目前预防HZ安全、有效的手段。

新型CHO/dhfr^-细胞定点整合和表达系统的建立

目的 :建立CHO/dhfr-细胞的定点整合和表达系统。方法 :利用常规分子生物学方法 ,构建了一个新的高效筛选表达载体 ,该载体含有一个由FRT(flprecombinationtarget)位点、报告基因 (LacZ)及筛选基因 (zeocin)三片段构成的融合基因 ,而且该基因的表达受一个弱化的SV4 0启动子的控制。借助于随机整合及高效筛选 ,实现FRT位点在CHO/dhfr-细胞基因组中转录活跃区的整合 ,然后利用该位点介导的特异性重组实现了目的基因 (单链抗体 尿激酶融合基因 )的定点整合和有效表达 ,而且随后通过DHFR/MTX系统的加压扩增 ,以提高单链抗体 尿激酶融合基因在宿主细胞中的表达水平。结果与结论 :获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系 ,并利用该细胞系实现了单链抗体 尿激酶融合基因的高表达 ,表达量达到 5 μg/ (10 6细胞·2 4h)。

截短型人骨保护素在CHO-DHFR^-细胞中的表达及活性测定

目的:构建截短型人骨保护素(hTOPG)哺乳动物表达载体pcDNA3.1/DHFR-hTOPG,实现其在CHO-DHFR-细胞中的高效表达,获取生物活性较高的重组蛋白。方法:利用基因重组技术构建重组表达载体pcDNA3.1/DHFR-TOPG,按LipofectamineTM2000试剂盒说明书转染CHO-DHFR-细胞,以含50 mL/L透析血清的IMDM培养基培养,氨甲喋呤(MTX)加压筛选高表达细胞株,ELISA法和RT-PCR法测定重组蛋白和基因的表达,并采用破骨细胞样细胞(OLC)诱导分化抑制实验测定重组蛋白的体外活性。结果:重组蛋白的表达量最高可达6 mg/L.72 h,且能够明显抑制OLC生成(P<0.05)。结论:截短型人OPG在CHO-DHFR-细胞中成功高效表达,并具有良好的生物学活性,为进一步的实验研究和临床应用提供了基础。

太空环境改变生物工程细胞CHO(dhfr^-)的生长特性

目的 :了解太空诱变对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法 :将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 1 8颗返回式卫星 ,经 1 8天太空飞行 ,回收后对存活细胞进行单克隆化 ,获得 1 5 9株单克隆细胞。选取生长快、慢不同的 3株克隆 ,利用光镜、MTT法、FCM分析及3 H掺入法观察细胞生长特性。结果 :经太空诱变后 ,CHO(dhfr-)细胞呈多种形态 ;G1期细胞显著增多 ;生长速度和大分子生物合成呈现多向性变化 ,无特定规律性。结论 :太空环境可影响生物工程细胞CHO(dhfr-)的生长特性 ,为进一步筛选优化的生物工程细胞提供了可能。

空间诱变致生长减慢CHO(dhfr^-)细胞株的特性

目的了解空间环境下生物工程细胞CHO(dhfr-)在形态、生长和周期等方面的变化。方法将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 18颗返回式卫星 ,返地的细胞在倍增之前进行单克隆化。从中随机选取 4株细胞 ,经 5代培养确定一株生长速度最慢的细胞株 ,利用光镜、MTT法、FCM分析法观察细胞生长特性。结果返地后的CHO (dhfr-)细胞经过单克隆化、扩增 ,获得 15 9个细胞株。经空间诱变后的细胞出现细胞形态改变、生长增殖速度减慢、G1期细胞明显增多。结论生物工程CHO(dhfr-)细胞经空间诱变可引起生长特性的改变 ,为筛选优化的生物工程制药细胞提供可能。

稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系,为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料,本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合,克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中,包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞,经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选,基因水平和蛋白水平表达验证,成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系,为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。

利用CHO(dhfr^-)细胞高效表达GM-CSFFc_(γ2)^-融合蛋白

目的 利用二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )高效表达融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。方法 利用脂质体基因转染技术 ,把含有融合基因GM -CSF Fcγ2-的真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-和含有二氢叶酸还原酶基因的真核表达质粒pSV2 -dhfr共转染二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )中。用G4 18和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷 )双筛选 ,获得dhfr +neo +双表型阳性的细胞克隆。取表达产量最高的克隆进行亚克隆 ,并行MTX加压筛选 ,以提高表达量。用RT -PCR、ELISA和Westernblot对表达产物进行鉴定并行MTT法检测表达蛋白的生物学活性。结果 成功地表达出了具有GM -CSF生物学活性的融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。结论 该方法可行 ,表达量达到 15μg ml。

慢病毒介导的稳定表达鸭干扰素-γ细胞株的构建

干扰素-γ是一种具有抗病毒活性和免疫调节能力的细胞因子之一。为了建立稳定表达鸭干扰素-γ(duIFN-γ)的细胞系,本研究优化并合成了duIFN-γ基因,插入到慢病毒表达载体plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro,获得重组质粒plenti-IFN,将plenti-IFN与辅助质粒共转染包装细胞293T,筛选出了携带duIFN-γ基因的重组慢病毒rlenti-IFN,将该病毒感染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,利用有限稀释法和抗性加压筛选法,筛选出了30个具有嘌呤霉素抗性基因的单克隆细胞系。利用RT-qPCR荧光定量法对这些单克隆细胞的duIFN-γ mRNA水平进行检测,筛选出了duIFN-γ mRNA水平最高的1个单克隆细胞,对其进行扩大培养,获得了1株稳定细胞系。Western blot检测结果表明,duIFN-γ稳定表达于该细胞系中。本研究获得了1株稳定表达duIFN-γ蛋白的细胞系,该研究为开展duIFN-γ生物学功能研究、建立duIFN-γ检测方法及生产廉价鸭(禽)用干扰素奠定了基础。

稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示,稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立,并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白;且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好,具有良好的免疫原性,中和效价为1∶128。综上,成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系,且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。

不同亚型CHO宿主细胞对抗体表达的影响

CHO细胞作为宿主细胞广泛应用于生物药工业化生产中。其中,CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S是最常见的3种亚型。虽然这些亚型是从共同的原始CHO细胞分离出来的,但在不同的实验室或生物医药公司、研究人员、培养基或培养方式下连续传代、驯化和保存,使得CHO细胞积累了大量变异,导致宿主细胞应用于抗体药生产时会在细胞生长状态、抗体表达量及以糖型为代表的质量属性方面表现出较大差异。综述了CHO细胞不同亚型的染色体差异、生长状态、表达差异以及糖型差异,以期为抗体药物研发中宿主细胞的选择提供参考。

细胞色素P450 3A4基因C239S突变体稳定表达Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立

目的构建稳定表达细胞色素P450家族3亚家族A成员4(CYP3A4)的C239S突变体(CYP3A4-C239S)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法使用Lipofectamine2000转染试剂将pcDNA5/FRT-CYP3A4-C239S突变型重组质粒和pcDNA5/FRT-空质粒转染至Flp-In TM CHO细胞,潮霉素B(500 g/L)进行稳定筛选,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中CYP3A4-C239S的mRNA和蛋白表达,采用黄曲霉素B1(AFB1)细胞毒性实验检测细胞活性。结果与Flp-In^(TM)CHO-空质粒组相比,Flp-In^(TM)CHO-3A4-C239S组的CYP3A4-C239S mRNA和蛋白表达水平均显著增加(P<0.001),AFB1细胞毒性实验显示,CYP3A4-C239S细胞组对AFB1的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建了稳定表达CYP3A4-C239S的Flp-In^(TM)CHO细胞系,且为后续研究CYP3A4突变对药物代谢的影响支撑基础。

过量表达CHO细胞内源性糖基化酶对抗体五聚甘露糖修饰的影响

目的研究CHO K1细胞内源性糖基化酶对细胞的生长代谢以及抗体中五聚甘露糖(Man5)水平的影响。方法构建含有抗体基因、糖基化酶基因共转染的CHO K1稳定细胞株以及空载细胞株,检测细胞群和克隆阶段的抗体滴度、Man5水平,使用RT-qPCR的方法检测过表达基因的转录水平,并分析单克隆细胞基因转录水平与Man5含量的相关性。结果研究显示,过表达糖基化酶基因后对细胞生长代谢的影响相对较小,糖基化酶基因单独过表达对降低蛋白中的Man5含量没有效果。将基因Man2a2和Mgat2组合过表达之后,可以将Man5的水平降低70%~80%,两个基因的转录水平都较高的情况下对降低Man5含量可以起到更加显著的作用。结论糖基化酶基因Man2a2和Mgat2组合过表达可以显著降低抗体蛋白中的Man5水平。

糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1融合蛋白在CHO/DHFR-细胞的稳定表达

目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检测。结果经G418筛选和MTX加压扩增,获得高效表达目的蛋白的细胞株。膜蛋白经WesternBlot检测具有生物活性。结论GPIB71在CHO/DHFR-细胞中高效表达,为临床应用与研究奠定了基础。

山药提取物对CHO细胞生长及抗体表达的影响

探究山药提取物(Dioscorea oppsita extract,DOE)对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)生长及抗体表达的影响。通过添加不同浓度的DOE,采用流加培养的方式,分别测定细胞密度、细胞活力、细胞上清中抗体表达量、单抗体含量,检测抗体电荷变体并分析抗体的糖基组成及相对含量和蛋白相对结合活性,以及在细胞生长过程中测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。结果表明,5 mg·mL^(-1)DOE可以明显地促进CHO细胞的生长,提高活细胞密度、细胞活力和SOD活性并降低MDA含量、提高细胞内抗体和单抗含量。添加DOE在一定程度上能够改变抗体某些糖型含量,且随着DOE浓度的增加,糖型G0F和Man5相对含量呈现先降低后缓慢增加的趋势,G1F糖型含量则逐渐升高,G0则变化较小相对较稳定。添加DOE后,抗体中酸性电荷变体、主峰和碱性电荷变体含量均不存在统计学差异(P>0.05),其抗体相对结合活性均保持在参比品的102%~135%之间,DOE不影响抗体的结合活性。综上所述DOE在细胞培养过程中对细胞的生长、抗体的表达方面发挥着重要作用,添加5 mg·mL^(-1)DOE对细胞生长的促进作用和抗体表达效果最佳,研究结果为中药提取物对CHO细胞的生长及抗体表达方面的研究提供了参考。

proUK-KGDW融合基因在CHO细胞中的高表达

利用常规分子生物学技术,构建了新型高效的proUK-KGDW融合基因的分泌型哺乳动物细胞表达载体。将该载体线性化后转染CHO/dhfr-细胞,经G418筛选获得阳性克隆,然后挑取表达水平较高的克隆进行MTX加压扩增,以提高proUK-KGDW杂合体的表达水平,经2～3轮MTX加压扩增,获得多株表达水平超过10μg/(106细胞·24h)的稳定的高表达细胞株,为proUK-KGDW杂合体的制备及功能研究奠定了基础。

定点整合人Bcl-2基因的CHO/dhfr-细胞株的建立

构建重组载体质粒pMCEfrt-Bcl-2,利用FIp-InTM定点重组系统,在CHO-dhfr-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNALadder检测在高NH4Cl条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血清IMDM培养基中细胞的活细胞数目和活细胞比例。结果获得了稳定表达Bcl-2基因的细胞株CHO-Bcl-2,该细胞株能高水平表达Bcl-2蛋白。在无血清培养过程中,CHO-Bcl-2细胞比对照细胞保持高约15%的活细胞比例,细胞总数高25%。CHO-Bcl-2在高NH4+(50mmol/L)培养条件下具有较低的凋亡水平。建立了能够高表达Bcl-2基因并具有一定的抗凋亡能力的重组CHO/dhfr-细胞株。