水解物对CHO细胞培养工艺的影响

目的对比3种水解物对CHO悬浮培养细胞生长的影响,以及对细胞分泌表达的抗体质量的影响。方法应用3种不同来源的水解物,采用摇瓶培养CHO细胞,观察培养过程中细胞密度、活性和代谢产物的变化,以及抗体质量的影响。结果水解物对CHO生长无显著促进作用、但可大幅度提高抗体产量;对抗体糖型无显著影响,可显著影响抗体电荷分布。结论3种水解物中,Preteose peptone和Phytone peptone对CHO有很好的促进作用。但Preteose peptone含有动物然产分,随着各国药监对动物来源成分监管制度的严格,将进一步限制Preteose peptone的应用,因此Phytone peptone具有优势。

柱前衍生化HPLC法测定CHO细胞培养上清中氨基酸浓度

以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰-亚氨基甲酸酯为柱前衍生化试剂,结合HPLC技术,首次建立了定量分析CHO细胞培养上清中氨基酸浓度的方法。选用Agilent 1260型高效液相色谱仪,AccQ-TagTM柱,以流动相A和流动相B[乙腈-水(60∶40,体积比)]进行梯度洗脱,荧光激发波长为250nm,发射波长为395nm,柱温为42.5℃,进样量为5μL。结果表明:21种氨基酸的线性回归系数均大于0.99,连续6次测定培养上清中氨基酸组分峰面积RSD均小于5%;21种氨基酸9次测定的平均加标回收率为96.8%,RSD为4.93%。该方法快速、简便、重复性好、结果准确,符合动物细胞培养上清中氨基酸分析的要求。

拉曼光谱用于CHO细胞培养液多指标快速分析

为了快速分析中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养液,在CHO细胞培养过程中取样,离线分析获得葡萄糖浓度、乳酸浓度、谷氨酸浓度、谷氨酰胺浓度、活细胞密度、总细胞密度、细胞活度和单克隆抗体表达量等指标的参考值,采集细胞培养液上清的拉曼光谱,以偏最小二乘(PLS)法建立拉曼光谱与各指标的多元校正模型。各模型均具有合理的主成分数、较高的决定系数(R^2)、较低的校正误差均方根(RMSEC)和预测误差均方根(RMSEP),且RMSEC与RMSEP相差不大,模型具有较好的预测性能。结果表明,该方法可望用于CHO细胞培养过程多指标离线快速检测,也为该生产过程在线实时监测和反馈控制的实现提供了研究基础。

基于紫外-可见光谱的CHO细胞培养液快速分析方法

为了建立基于紫外-可见(UV-Vis)光谱和酚红的快速分析方法,用于同时测定细胞培养液中葡萄糖(Gluc)和乳酸(Lac)质量浓度、谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)浓度及活细胞密度(VCD)、总细胞密度(TCD)、细胞活度(Viability)和单克隆抗体表达量(Titer),将细胞培养液上清与酚红溶液混合,采集混合溶液的UV-Vis光谱,以偏最小二乘(PLS)法建立UV-Vis光谱与各指标的多元校正模型。发现Lac质量浓度、Glu浓度、VCD、TCD、Viability和Titer模型预测性能较好;Gluc质量浓度和Gln浓度模型预测性能较差。结果表明,将该方法应用于细胞培养过程多指标快速分析具有一定可行性,为生产过程实时监控提供了研究基础。

CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析

旨在利用悬浮培养CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白,并鉴定纯化E2蛋白的免疫原性。本研究以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建BVDV E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2,转染经悬浮培养的CHO细胞进行分泌表达,收集细胞培养上清,进行亲和层析法纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达和纯化,Western blot鉴定与His抗体和BVDV阳性血清反应性,利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔,用细胞间接免疫荧光(IFA)和ELISA鉴定E2蛋白的反应活性。纯化E2蛋白经BCA蛋白定量试剂盒检测后表达量高达1.228 mg·mL^(-1);Western blot结果显示,利用His抗体和BVDV阳性血清均可检测到目的蛋白的特异性条带;新西兰大白兔一免后第7天利用间接ELISA可检测到血清抗体阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平达到1∶1024000;IFA试验结果显示,该血清抗体可检测到BVDV感染MDBK细胞中E2蛋白的表达,进一步证实纯化的E2蛋白具有良好的免疫原性和特异性。本研究成功利用CHO悬浮培养真核表达系统制备了纯化的BVDV E2蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为BVDV的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。

氨浓度升高对CHO细胞维持期抗体融合蛋白的表达及N-糖基化的影响

为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关系。结果显示,氨浓度在5-12 mmol/L范围内对维持期的细胞生长曲线、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成情况没有明显影响。但当氨浓度大于5 mmol/L时,随着氨浓度的升高,抗体融合蛋白的唾液酸化程度和半乳糖化程度均不断降低,而岩藻糖基化程度和高甘露糖糖型比例则没有变化。当氨浓度升高至大于9 mmol/L后,抗体融合蛋白的表达能力和最终表达量开始降低。因此,应在细胞培养工艺过程开发时控制氨的生成至小于5 mmol/L,以避免氨的累积导致产物的半乳糖化和唾液酸化程度降低以及产物表达量下降。

CHO细胞表达系统研究进展

CHO细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展,CHO细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统,并被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中。近年来,针对CHO细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足,研究者们通过利用基因工程技术手段,结合重组蛋白表达机制的研究成果,为优化和应用CHO细胞表达系统做出了不懈努力。从培养基的优化、高产重组CHO细胞株的构建、大规模培养三个方面综述了CHO细胞表达系统的最近研究进展,以期为CHO细胞表达系统的研究与应用提供参考。

CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2-E^(rns)融合蛋白及免疫原性分析

本研究旨在利用CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2-E^(rns)融合蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建融合表达BVDV E2和E^(rns)蛋白的真核重组表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2-E^(rns),转染CHO细胞,进行上清分泌表达;离心收集细胞培养上清进行亲和层析纯化,通过SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定纯化蛋白的免疫反应性;使用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,通过细胞免疫荧光(IFA)试验和间接ELISA试验鉴定E2-E^(rns)融合蛋白免疫家兔血清的抗体反应性和抗体效价。结果,通过CHO细胞表达系统,成功制备了纯化的BVDV E2-E^(rns)融合蛋白,Western-blot鉴定结果显示,His标签单克隆抗体和BVDV阳性血清均能够与纯化的融合蛋白发生特异性免疫反应。间接ELISA和IFA试验结果显示,一免后第7天血清抗体呈阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平可达1∶512000,且该血清抗体可以与MDBK细胞中感染的BVDV发生特异性免疫反应。上述结果表明,本研究成功利用CHO细胞表达系统制备并纯化了BVDV E2-E^(rns)融合蛋白,并通过体内和体外试验证明该融合蛋白具有良好的免疫原性,为BVD的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)蛋白的中华仓鼠卵巢细胞表达及免疫原性分析

本研究利用中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E^(rns)蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL标准毒株基因序列为基础,构建BVDV E^(rns)蛋白重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E^(rns),转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达。SDS-PAGE分析E^(rns)蛋白的表达和纯化,并用抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清进行Western blotting鉴定纯化蛋白;进一步使用纯化的E^(rns)蛋白免疫新西兰大白兔,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)实验检测血清抗体水平及其免疫反应活性,用病毒中和实验测定免疫兔血清的中和抗体滴度。BCA蛋白定量试剂盒检测纯化的E^(rns)蛋白浓度为0.886 mg/m L,Western blotting结果显示,抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清均能够与纯化的E^(rns)蛋白发生特异性免疫反应。间接ELISA和IFA实验结果显示,一免后第7天血清抗体呈阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平可达1:128000,且该血清抗体可以与MDBK细胞中感染的BVDV病毒发生特异性免疫反应。重组E^(rns)蛋白免疫兔可诱导动物机体产生病毒中和抗体,中和效价为log10=2.71。本研究利用CHO细胞表达系统成功制备了纯化的BVDV E^(rns)蛋白,并通过体内和体外实验证明,该重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)诊断方法及新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。

机械搅拌式动物细胞反应器不同桨型组合的CFD数值模拟与优化

生物反应器已成为哺乳动物细胞生产治疗性抗体药物和疫苗的核心。文中采用CFD数值模拟方法对目前常用的机械搅拌式生物反应器在不同的搅拌形式下的流场进行了分析,获得了5种搅拌桨型组合条件下的速率矢量、持气率、含气率和剪切力分布的特征。通过构建的重组CHO细胞在不同搅拌形式条件下的流加分批培养发现,细胞密度和抗体表达水平与反应器内的最大剪切率直接相关,在FBMI3搅拌形式下细胞密度和抗体表达水平均最高。结果表明该CHO细胞在悬浮培养时对剪切环境比较敏感,且最大剪切力是工业规模放大的关键因素。