CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(PCR-Taqman探针法)的方法学验证

目的:中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)宿主细胞DNA残留检测(PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法:利用磁珠分离法结合Taqman探针定量PCR技术,对自主研制的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限、参考品DNA标定等验证。特别针对残留定量限、蛋白浓度、pH值、缓冲体系等关键影响因素,以及生产工艺各中间品进行回收率考察,验证试剂盒对复杂样品的检测性能。选取采用不同工艺的多个重组蛋白产品,通过独立三方协作标定,开展试剂盒的适用性研究。结果:DNA标准曲线在3 fg·μL-1～300 pg·μL-1范围内,线性良好(R2> 0. 99);对5个浓度梯度检测的准确度偏差均<10%;定量限为0. 5 fg·μL-1;内部参考品DNA标定结果为10μg·m L-1;精密度良好(RSD≤15%);大鼠、小鼠、大肠杆菌、人类基因组DNA对检测无干扰。另外,对于样品中DNA含量在1pg·m L-1～10 ng·m L-1、pH值在4～9,采用磷酸缓冲体系、Tris缓冲体系、醋酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系等多种基质样品,以及生产工艺中间品的检测回收率均在70%～130%,RSD均<15%。3个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论:自主研发CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(荧光探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足复杂基质条件下各种重组制品的宿主DNA残留检测要求。

对疫苗DNA残留的检测

对所使用的疫苗，我们最关心的是疫苗的效果和其安全性。现在很多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组（CHO细胞）乙肝疫苗，Vero细胞狂犬病疫苗等大多数疫苗都是用细胞培养的方法生产，而对疫苗的纯化是关键问题，我们要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。就以疫苗残留DNA为例，残留DNA可能造成插入突变、导致抑癌基因失活、癌基因被激活等，最终造成疫苗使用者致癌。